基因工程原理-第章外源目的基因表达与调控课件

DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程的应用1.DNA重组（限制性内切酶）1.目的基因载体受体细胞外源基因表达DNA重组载体2.目的基因载体受体细胞外源基因表达DNA重组载体2.第六章外源目的基因表达与调控3.第六章外源目的基因表达与调控3.第一节外源基因表达机制DNA转录翻译ATCGAUCG43=64遗传密码氨基酸折叠密码RNA蛋白质4.第一节外源基因表达机制DNA转录翻译AA43=64遗传密码。5.。5.转录过程启动子和调控序列——转录的关键原核生物启动子：lac、trp、λPR、λPl等一、外源基因的起始转录6.转录过程启动子和调控序列——转录的关键一、外源基因的起始转录7.7.二、外源基因mRNA的有效翻译起始密码子：AUG是首选核糖体结合位点SD序列AGGAGG：至少包含4个碱基SD与AUG之间距离为3-9个碱基翻译起始区不应形成二级结构真核细胞无SD序列，但大多含共同序列：5’-CCA(G)CCAUGG-3’8.二、外源基因mRNA的有效翻译起始密码子：AUG是首选真核细（1）氨基酸活化和肽链的起始：AA+tRNA+ATP——AA-tRNA+AMP+PPi（2）肽链的起始：原核生物：30S+mRNA——+AA-tRNA——+50S真核生物：40S+AA-tRNA——+mRNA——+60S（3）肽链的延伸：肽基转移酶（4）肽链的终止：终止密码子(UAA、UAG、UGA)和终止因子（5）折叠和加工翻译过程9.（1）氨基酸活化和肽链的起始：翻译过程9.氨酰tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRAN合成酶

氨基酸的活化10.氨酰tRNAaa＋tRNA+ATPa11.11.B：延伸12.B：延伸12.C：终止13.C：终止13.

DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。一、启动子（promoter)：第二节基因表达的调控元件

特征：序列特异性：不同启动子对RNA聚合酶亲和力不同方向性：5‘→3’位置特异性：位于调控基因的上游种属特异性：亲缘越近通用的可能性越大14.DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的转录起始点：通常是一个嘌呤(A或G)Pribnow框，又叫-10区：TATAATSextama框，又叫-35区：TTGACA间隔区（一）原核生物的启动子典型的原核启动子有四大要素：15.转录起始点：通常是一个嘌呤(A或G)（一）原核生物的启动子典TATAATTATAATTTGACAA/GTTGACAA/G16.TATAATTATAATTTGACAA/GTTGACAA/GPribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列Sextamabox17.Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列SexrRNA基因启动子（Ⅰ型）：rRNAmRNA基因启动子（Ⅱ型）：mRNA、部分核内小分子RNA（snRNA）tRNA基因启动子（Ⅲ型）：5SrRNA、tRNA、snRNA（二）真核生物的启动子18.rRNA基因启动子（Ⅰ型）：rRNA（二）真核生物的启动子1rRNA基因启动子（Ⅰ型）核心启动子（corepromoter）（-45—+20位核苷酸）上游调控元件（-170—-107位序列）（增强转录效率）（单独存在即可起始转录）19.rRNA基因启动子（Ⅰ型）核心启动子（corepromotmRNA基因启动子（Ⅱ型）没有广泛的同源性多数含TATA序列,通常处于-30区无TATA盒的启动子称无TATA盒启动子20.mRNA基因启动子（Ⅱ型）没有广泛的同源性20.tRNA基因启动子（Ⅲ型）21.tRNA基因启动子（Ⅲ型）21.真核和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNApol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。22.真核和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，二、增强子(enhancer)：增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。特性：双向性重复序列功能与位置无关组织特异性可调控同源基因和异源基因23.二、增强子(enhancer)：增强基因启动子工作效率的结构基因的增强子24.结构基因的增强子24.1.增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍!2.增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3kp，或在基因下游，均表现出增强效应；3.大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；25.1.增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-2004.增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5.没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6.许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。26.4.增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质细胞专一性增强子：许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。诱导性增强子：这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。27.细胞专一性增强子：许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性三、沉默子(silencer) 是真核基因中的一种特殊的序列，与增强子有许多类似之处。沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。28.三、沉默子(silencer) 是真核基因中的一种特殊的序四、绝缘子（insulator）真核生物基因组的调控元件之一，是一种边界元件。绝缘子能够阻止邻近的增强子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥调控作用。绝缘子的抑制作用具有“极性”的特点，即只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子或沉默子，而对处于同一染色质结构域内的增强子或沉默子没有作用29.四、绝缘子（insulator）真核生物基因组的调控元件之转录因子的作用方式：30.转录因子的作用方式：30.终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵子末端的DNA片段，可中断转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括：本体转录终止子（Intrinsictranscriptionterminators），一个发夹结构。ρ-依赖转录终止子（Rho-dependenttranscriptionterminators），ρ因子与RNA螺旋酶蛋白复合物。五、终止子(terminator):（一）原核生物的终止子

31.终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵子末端的Dρ-依赖转录终止子32.ρ-依赖转录终止子32.本体转录终止子33.本体转录终止子33.富含GC34.富含GC34.35.35.回文结构：palindromestructure,双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构。这两个反向重复序列不一定是连续的36.回文结构：palindromestructure,双链D（二）真核生物的终止子

真核生物终止子，在mRNA前体的近3'-端处转录产生一组共同序列，即AAUAAA和GU-rich序列，为转录终止的识别位点和poly(A)修饰识别位点。在转录越过修饰点后，RNA链在修饰点处被水解切断，转录终止，随即进行加尾修饰。37.（二）真核生物的终止子真核生物终止子，在mRNA前体的近一、大肠杆菌基因表达系统1.复制子常见复制子：pMB1、ColE1、pSC101。松弛型复制子，10-20个拷贝/细胞第三节外源基因表达与调控（一）大肠杆菌基因表达载体38.一、大肠杆菌基因表达系统1.复制子第三节外源基因表达与调（二）宿主菌39.（二）宿主菌39.（三）常见的大肠杆菌表达系统40.（三）常见的大肠杆菌表达系统40.1.Lac表达系统包括正调控系统和负调控系统：CAP因子：环腺苷酸(cAMP)与受体蛋白CRP(cAMPreceptorprotein)结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP(cAMPactivatedprotein)，促进RNA聚合酶结合在启动子上。正调控系统：调控因子CAP负调控系统：负调控因子lacI41.1.Lac表达系统包括正调控系统和负调控系统：CAP因子：…RPOS1S2……DNA调节基因启动基因操纵基因结构基因与阻遏蛋白结合1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点产生阻遏蛋白mRNA操纵子42.…RP（四）外源基因在大肠杆菌中的表达形式包涵体——在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构。1.包涵体蛋白具有正确的氨基酸顺序，但没有生物活性；水难溶的性质；少受受体细胞蛋白酶影响；易于分离纯化。43.（四）外源基因在大肠杆菌中的表达形式包涵体——在一定条件下优点：缺点：44.优点：缺点：44.融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变2个基因阅读框，以这种方式表达的蛋白叫融合蛋白。2.融合蛋白受体菌蛋白N端，外源蛋白在C端稳定性大大增加水溶性好易于分离纯化。45.融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但构建表达载体时，将多个外源基因串联连接，形成寡聚型外源蛋白。有3种方式：多表达单元的重组：每单元有自己的表达调控系统，表达的蛋白不须裂解处理。多顺反子重组：共同启动子和终止子，各自的表达单元：SD序列、翻译起始合终止信号。多编码序列重组：共同表达调控系统，但各外源基因接口有蛋白酶切位点。3.寡聚型外源蛋白46.构建表达载体时，将多个外源基因串联连接，形成寡聚型外源蛋白。——将外源基因整合到宿主细胞染色体上，必须整合到染色体的非必需区同源交换选择不能在受体细胞自主复制的质粒。4.整合型外源蛋白47.——将外源基因整合到宿主细胞染色体上，4.整合型外