基础生物化学生物氧化

基础生物化学生物氧化基础生物化学生物氧化基础生物化学生物氧化基础生物化学生物氧化基础生物化学生物氧化基础生物化学生物氧化16.1生物氧化概述6.1.1生物氧化的概念6.1.1.1生物氧化的主要内容生物氧化（biologicaloxidation）是生物细胞将糖、脂和蛋白质等有机物进行氧化分解，最终生成CO2和H2O并释放能量的过程，也称为细胞呼吸（cellularrespiration）。6.1生物氧化概述2代谢物在体内的氧化可以分为3个阶段：①糖、脂肪和蛋白质经过分解代谢生成乙酰辅酶A中的乙酰基。②乙酰辅酶A进入三羧酸循环脱氢，生成CO2并使NAD和FAD还原成NADH、FADH2。③NADH和FADH2中的氢经呼吸链将电子传递给氧生成水，氧化过程中释放出来的能量用于ATP合成。狭义地说只有第3个阶段才是生物氧化，这是体内能量生成的主要阶段。代谢物在体内的氧化可以分为3个阶段：36.1.1.2生物氧化的特点生物体内进行的氧化反应与体外氧化反应都遵循氧化反应（脱氢、脱电子和加氧等）的一般规律，最终氧化分解产物是CO2和H2O，同时释放能量。但是生物氧化反应又有其特点。6.1.1.2生物氧化的特点4①生物氧化中底物是在酶的催化下，经一系列连续的化学反应逐步氧化分解的，氧化过程产生的能量也是逐步释放的。②生物氧化产生的能量部分可转变成生命活动能够利用的形式，即合成ATP，不是全以热的形式释放。③生物氧化是在常温、常压、近中性pH的环境中进行。在真核细胞内，生物氧化主要是在线粒体中进行，原核细胞内生物氧化是在细胞膜上进行。①生物氧化中底物是在酶的催化下，经一系列连续的化学反应逐步氧56.1.1.3生物氧化中CO2和H2O的生成①CO2的生成代谢底物在酶的作用下经一系列脱氢、加水等反应，转变为含羧基的化合物，经脱羧反应生成CO2，包括直接脱羧和氧化脱羧。6.1.1.3生物氧化中CO2和H2O的生成6②H2O的生成生物氧化中底物脱下的氢与氧结合生成水。②H2O的生成76.1.2生物氧化的自由能变化6.1.2.1自由能概念生物体不能直接利用热能做动，在生命活动过程中所需的能量都来自体内生化反应释放的自由能。自由能(freeenergy)：在恒温、恒压条件下一个体系可用于做有用功的能量。又称Gibbs自由能，以G表示。6.1.2生物氧化的自由能变化86.1.2.3氧化还原电位生物体内进行的生化反应有许多是氧化还原反应，生物所需要的能量就来自于体内的氧化还原反应。在生物体中物质进行氧化-还原时，其基本原理和化学电池一致。在氧化-还原反应中，电子从还原剂传递到氧化剂。6.1.2.3氧化还原电位9标准状况下氧化还原电位变化：

E

′=标准氧化电极电位

标准还原电极电位E

′越大，得到电子的倾向越大，氧化能力越强；E

′越小，失去电子的倾向越大，还原能力越强。标准状况下氧化还原电位变化：106.1.3高能磷酸化合物6.1.3.1生物体内的高能化合物生命过程必须与放能反应偶联。生物氧化释放的能量一般先贮藏在高能化合物中，机体用于做功的能量来自高能化合物水解反应。这样，高能化合物就成为放能反应与吸能反应之间的能量梭。6.1.3高能磷酸化合物11高能化合物中含有高能键，高能键是指具有高的磷酸基团转移势能或水解时释放较多自由能的磷酸酐键或硫酯键。高能键是不稳定的键。ATP是最重要的高能化合物。高能化合物中含有高能键，高能键是指具有高的磷酸基团转移势能或12基础生物化学生物氧化13基础生物化学生物氧化14并非含磷酸基团的化合物均属于高能化合物，例如6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、3-磷酸甘油，它们水解时只释放出4.2~12.6kJ·mol-1的能量，因而属于低能磷酸化合物。并非含磷酸基团的化合物均属于高能化合物，例如6-磷酸葡萄糖、156.1.3.2ATP的结构及其在能量转换中的作用糖、脂肪和蛋白质是大多数生物赖以生存的主要能源物质，通过细胞呼吸作用使这些贮存能源物质氧化分解，同时释放出能量。释放的能量除一部分以热的形式散失于周围环境中之外，其余部分通过底物水平磷酸化或氧化磷酸化生成ATP，以高能磷酸键的形式存在。同时，ATP也是生命活动利用能量的主要直接供给形式。6.1.3.2ATP的结构及其在能量转换中的作用16中度体力劳动者每日每kg体重需供给能量34~40千卡，若一成人重70kg，从事中度体力劳动，则每日应供应含能量2450千卡的食物，其中40%的能量转变成化学能储存于ATP分子的高能键中，这一部分能量应为2450×0.4=980.0千卡，按每molATP水解生成ADP+Pi释放7.3千卡能量计算，应当合成：980÷7.3=134.3molATP，ATP的分子量为507.22，所以134.3molATP重达68.12kg，表明ATP在体内的代谢十分旺盛。中度体力劳动者每日每kg体重需供给能量34~40千卡，若一成17ATP的末端有两个以磷酸酐键连接的磷酸基，由于P＝O键的极化，电子云偏向氧原子，使磷原子带部分正电荷，相距很近的正电荷相互排斥，使磷酸酐键不稳定。ATP的末端有两个以磷酸酐键连接的磷酸基，由于P＝O键的极化18同时，在生理pH条件下，ATP约带4个空间距离很近的负电荷，它们之间相互排斥，使磷酸酸酐键易水解。当ATP水解生成ADP和Pi时，可部分消除这种应力，而且在生理pH下ADP和Pi都带负电荷，使平衡强烈地趋向水解，释放出大量自由能。同时，在生理pH条件下，ATP约带4个空间距离很近的负电荷，19ATP的合成可与放能反应偶联，利用其释放的能量由ADP和Pi合成ATP；在需要时又水解成ADP和Pi，同时将贮藏的能量释放出来，以推动各种耗能的生命活动。如分子和离子的跨膜主动运输、收缩蛋白的收缩、小的构件分子合成生物大分子等。ATP-ADP循环是生物系统的能量交换中枢。ATP的合成可与放能反应偶联，利用其释放的能量由ADP和P20ATP还可作为磷酸基团转移反应的中间载体。ATP水解时的标准自由能变化位于多种物质水解时标准自由能变化的中间，它能从具有更高能量的化合物接受高能磷酸键，ATP也能将～Pi转移给水解时标准自由能变化较小的化合物。ATP还可作为磷酸基团转移反应的中间载体。21为了衡量磷酸化合物中磷酸基团转移的热力学趋势，而引入磷酸基团转移势能，在数值上等于其水解反应的-

G0′。在磷酸基团转移反应中，磷酸基从转移势能较高的供体转移到转移势能较低的受体分子。ATP的磷酸基团转移势能在常见的含磷酸基团化合物中处于中间位置，因而在磷酸基团转移势能高的供体与低能的受体之间充当中间载体。为了衡量磷酸化合物中磷酸基团转移的热力学趋势，而引入磷酸基团22基础生物化学生物氧化23例如EMP生成的高能中间产物1,3-二磷酸甘油酸和PEP，在细胞内并不直接水解，而是经特殊激酶的作用，以转移磷酸基团的形式将捕获的自由能传递给ADP生成ATP。ATP又可通过酶促磷酸基团转移反应将磷酸酐键的大部分自由能传递给受体分子。例如葡萄糖和甘油，而形成6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油，使这些代谢物活化，以利于酶促反应的进行。例如EMP生成的高能中间产物1,3-二磷酸甘油酸和PEP，在24体内ATP处于消耗和补充的动态平衡中。估计每千克活动组织含有几个mmol·L-1的ATP，0.1mmol·L-1的ADP和0.01mmol·L-1的AMP，这要求ATP与ADP的转换速度能够随细胞生命活动的需求而不断变化。在一般组织中，ATP消耗过程的加速伴随着ATP合成过程的加速，ATP水解产物ADP的浓度对ATP的合成速度起直接调控作用。体内ATP处于消耗和补充的动态平衡中。估计每千克活动组织含有25而在动物肌肉、脑和神经等易兴奋组织中，当其发生快速反应时对高能磷酸化合物的立即需要大于ATP合成能力，例如人在剧烈活动时肌肉消耗ATP多达6mmol·L-1·kg-1·s-1，而在迟延几秒钟后发生的最大ATP合成为1mmol·L-1·kg-1·s-1。表明为了维持这些组织的快速反应和ATP的动态平衡，必须有一种便于利用的高能磷酸贮能物质。而在动物肌肉、脑和神经等易兴奋组织中，当其发生快速反应时对高266.1.3.3磷酸肌酸以高能磷酸形式贮能的物质统称磷酸原(phosphagens)，包括磷酸肌酸、磷酸精氨酸等。ATP是细胞内主要的磷酸载体或能量传递体，人体储存能量的方式不是ATP而是磷酸肌酸。磷酸肌酸存在于肌肉、脑和神经组织中，它可与ATP相互转化。ATP多时，以磷酸肌酸的形式贮能；ATP不足时，磷酸肌酸转化为ATP。肌肉中磷酸肌酸的含量比ATP约高3~4倍，足以维持ATP的恒定水平。6.1.3.3磷酸肌酸27肌细胞线粒体内膜和胞液中均有肌酸激酶。线粒体内膜的肌酸激酶主要催化正向反应，生成的ADP可促进氧化磷酸化，生成的磷酸肌酸逸出线粒体进入胞液，磷酸肌酸所含的能量不能直接利用；胞液中的肌酸激酶主要催化逆向反应，生成的ATP可补充肌肉收缩时的能量消耗，而肌酸又回到线粒体用于磷酸肌酸的合成。肌细胞线粒体内膜和胞液中均有肌酸激酶。线粒体内膜的肌酸激酶主28肌肉中磷酸肌酸的浓度为ATP浓度的5倍，可储存肌肉几分钟收缩所急需的化学能。肌肉中磷酸肌酸的浓度为ATP浓度的5倍，可储存肌肉几分钟收缩296.2呼吸链（电子传递链）6.2.1线粒体线粒体内膜是能量转换的重要部位，电子传递链和氧化磷酸化有关的组分都存在于此。原核细胞没有线粒体结构，它的部分质膜起着这种作用。6.2呼吸链（电子传递链）30线粒体是有两层膜，外膜平滑，透性高，仅有少量酶结合其上。内膜形成了许多向内褶叠的嵴，产能和需能越高的组织（如昆虫飞翔肌）嵴的数目也越多。嵴的形成有利于增加内膜的面积。线粒体是有两层膜，外膜平滑，透性高，仅有少量酶结合其上。内膜31基础生物化学生物氧化32内膜约含80％的蛋白质，包括电子传递链和氧化磷酸化的有关组分，是线粒体功能的主要担负者。线粒体的内腔充满半流动的基质（衬质），其中包含大量的酶类以及线粒体DNA和核糖体。线粒体基质酶类包括TCA酶类、脂肪酸

-氧化酶类和氨基酸分解代谢酶类。内膜约含80％的蛋白质，包括电子传递链和氧化磷酸化的有关组分33哺乳动物线粒体DNA为环状分子，编码包括细胞色素氧化酶、细胞色素b和F0疏水亚基在内的10多种蛋白质，约占内膜总蛋白质的20％，其余的蛋白质均由核基因编码，在细胞质中合成后运入线粒体。线粒体内膜的内表面有一层排列规则的球形颗粒，通过一个细柄与构成嵴的内膜相连接，这就是ATP合酶(偶联因子F1-F0)。哺乳动物线粒体DNA为环状分子，编码包括细胞色素氧化酶、细胞34基础生物化学生物氧化356.2.2电子传递链(electrontransferchain，ETC)电子传递链(呼吸链respiratorychain)是一系列电子载体按氧化还原电位梯度排列的电子传递系统，它将代谢物脱下的氢的电子传递给氧生成水，同时有ATP生成。所有组成成分都嵌合于线粒体内膜，并分段组成分离的复合物，在复合物内各载体成分的物理排列也符合电子流动的方向。6.2.2电子传递链(electrontransfer366.2.2.1电子传递链的组成电子传递链的组分包括递氢体(hydrogentransfer)和递电子体(eletrontransfer)。递氢体和递电子体是传递氢原子或电子的载体，由于氢原子可以看作是由H+和e组成的，所以递氢体也是递电子体，递氢体和递电子体的本质是酶、辅酶、辅基或辅因子。NAD、FAD、FMN、Fe-S、细胞色素和泛醌等。它们都是疏水性分子。除泛醌外，其他组分都是蛋白质通过其辅基的可逆氧化还原传递电子。6.2.2.1电子传递链的组成37①烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，辅酶I，CoI)。NAD是脱氢酶的辅酶，是连接作用物与呼吸链的重要环节。①烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，辅酶I，CoI)。38NAD的主要功能是接受从代谢物上脱下的2H(2H++2e)，并传给另一传递体黄素蛋白。在生理pH条件下，烟酰胺中的氮(吡啶氮)为五价的氮，它能可逆地接受电子而成为三价氮，与氮对位的碳也较活泼，能可逆地加氢还原，故可将NAD视为递氢体。反应时，NAD的尼克酰胺部分可接受一个氢原子及一个电子，还有一个质子(H+)留在介质中。NAD的主要功能是接受从代谢物上脱下的2H(2H++2e)39烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，辅酶Ⅱ，CoⅡ)也是有些脱氢酶的辅酶，它与NAD不同之处是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羟基的氢被磷酸基取代而成。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，辅酶Ⅱ，CoⅡ)也是有些40当此类酶催化代谢物脱氢后，其辅酶NADP接受氢而被还原生成NADPH，它须经吡啶核苷酸转氢酶(pyridinenucleotidetranshydrogenase)作用将还原当量转移给NAD，然后再经呼吸链传递，但NADPH一般是为合成代谢或羟化反应提供氢。当此类酶催化代谢物脱氢后，其辅酶NADP接受氢而被还原生成N41②黄素蛋白(flavoproteins)与电子传递链有关的黄素蛋白有两种，分别以FMN和FAD为辅基。②黄素蛋白(flavoproteins)42在FAD、FMN分子中的异咯嗪部分可进行可逆的脱氢加氢反应。氧化型黄素辅基从NADH接受两个电子和一个质子，或从底物(如琥珀酸)接受两个电子和两个质子而还原：NADH+H++FMN=NAD++FMNH2琥珀酸+FAD=延胡索酸+FADH2在FAD、FMN分子中的异咯嗪部分可进行可逆的脱氢加氢反应。43FAD或FMN与酶蛋白部分之间是通过非共价键相连，但结合牢固，因此氧化与还原都在同一个酶蛋白上进行，故黄素核苷酸的氧化还原电位取决于和它们结合的蛋白质，所以有关的标准还原电位指的是特定的黄素蛋白，而不是游离的FMN或FAD；在电子转移反应中它们只是在黄素蛋白的活性中心部分，而其本身不能作为作用物或产物，这和NAD不同，NAD与酶蛋白结合疏松，当与某酶蛋白结合时可以从代谢物接受氢，而被还原为NADH，游离的NADH可再与另一种酶蛋白结合，释放氢后又被氧化为NAD。FAD或FMN与酶蛋白部分之间是通过非共价键相连，但结合牢固44很多黄素蛋白参与呼吸链组成，与电子转移有关。如NADH脱氢酶以FMN为辅基，是呼吸链的组分之一，介于NADH与其它电子传递体之间；琥珀酸脱氢酶，线粒体内的甘油磷酸脱氢酶的辅基为FAD，它们可直接从作用物转移H++e到呼吸链。脂肪酰CoA脱氢酶（FAD为辅基）与琥珀酸脱氢酶相似，也能将氢从作用物传递进入呼吸链，但还需电子转移黄素蛋白(辅基为FAD)参与才能完成。很多黄素蛋白参与呼吸链组成，与电子转移有关。如NADH脱氢酶45③铁硫蛋白(ironsulfurproteins,Fe-S)是含铁硫络合物的蛋白质，又称非血红素铁蛋白（或铁硫中心），其特点是含铁原子。铁与无机S原子或与肽链上Cys残基的硫结合。③铁硫蛋白(ironsulfurproteins,Fe46常见的铁硫蛋白有3种组合方式a、单个铁原子与4个Cys残基上的-SH硫相连。b、2个铁原子、2个无机硫原子组成(2Fe-2S)，其中每个铁原子还各与两个Cys残基的-SH硫相结合。c、由4个铁原子与4个无机硫原子相连(4Fe4S)，铁与硫相间排列在一个正六面体的8个顶角端；此外4个铁原子还各与一个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。常见的铁硫蛋白有3种组合方式47基础生物化学生物氧化48铁硫蛋白在氧化态时两个铁均为Fe3+，在还原态时变为Fe2+。由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。铁硫蛋白在氧化态时两个铁均为Fe3+，在还原态时变为Fe2+49④泛醌(ubiquinone,UQ或Q)也称辅酶Q(coenzymeQ)，为一脂溶性苯醌，带有一很长的脂肪族侧链，易结合到膜上或与膜脂混溶。UQ由多个异戊二烯单位构成，不同来源的泛醌其异戊二烯单位的数目不同，在哺乳类动物组织中最多见的泛醌其侧链由10个异戊二烯单位组成。④泛醌(ubiquinone,UQ或Q)50UQ的功能基团是苯醌，泛醌接受一个电子和一个质子还原成半醌，再接受一个电子和质子则还原成二氢泛醌，后者又可脱去电子和质子而被氧化恢复为泛醌。UQ的功能基团是苯醌，泛醌接受一个电子和一个质子还原成半醌，51⑤细胞色素体系1926年Keilin首次使用分光镜观察昆虫飞翔肌振动时，发现有特殊的吸收光谱，因此把细胞内的吸光物质定名为细胞色素。⑤细胞色素体系52细胞色素是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白，属于递电子体。线粒体内膜中有细胞色素b、c1、c、aa3，肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素P450。细胞色素b、c1、c为红色细胞素，细胞色素aa3为绿色细胞素。不同的细胞色素具有不同的吸收光谱，不但其酶蛋白结构不同，辅基的结构也有一些差异。细胞色素是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白，属于递电子体。53细胞色素c为一外周蛋白，位于线粒体内膜的外侧。细胞色素C比较容易分离提纯，其结构已清楚。哺乳动物的Cytc由104个氨基酸残基组成，并从进化的角度作了许多研究。Cytc的辅基血红素(亚铁原卟啉)通过共价键(硫醚键)与酶蛋白相连，其余各种细胞色素中辅基与酶蛋白均通过非共价键结合。细胞色素c为一外周蛋白，位于线粒体内膜的外侧。细胞色素C比较54细胞色素a和a3不易分开，统称为细胞色素aa3。和细胞色素P450、b、c1、c不同，细胞色素aa3的辅基不是血红素，而是血红素A。细胞色素aa3可将电子直接传递给氧，因此又称为细胞色素氧化酶。细胞色素a和a3不易分开，统称为细胞色素aa3。和细胞色素P55铁卟啉辅基所含Fe2+可有Fe2+=Fe3++e的互变，因此起到传递电子的作用。铁原子可以和酶蛋白及卟啉环形成6个配位键。细胞色素aa3和P450辅基中的铁原子只形成5个配位键，还能与氧再形成一个配位键，将电子直接传递给氧，也可与CO、氰化物、H2S或叠氮化合物形成一个配位键。细胞色素aa3与氰化物结合就阻断了整个呼吸链的电子传递，引起氰化物中毒。铁卟啉辅基所含Fe2+可有Fe2+=Fe3++e的互变，因此56电子传递链组分除泛醌和细胞色素c外，其余组分实际上形成嵌入内膜的结构化超分子复合物。用毛地黄皂苷、胆酸盐等去垢剂处理分离的线粒体时，可溶解外膜，并将内膜分裂成四种仍保存部分电子传递活性的复合物。①复合物I(NADH脱氢酶)相对分子质量约70万~90万，含有25种不同的蛋白质，包括以FMN为辅基的黄素蛋白和多种铁硫蛋白，催化电子从NADH转移到泛醌。电子传递链组分除泛醌和细胞色素c外，其余组分实际上形成嵌入内57②复合物Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)相对分子质量约14万，含有4～5种不同的蛋白质，包括以FAD为辅基的黄素蛋白、铁硫蛋白和细胞色素b560，催化电子从琥珀酸传递到泛醌。③复合物Ⅲ(细胞色素b、cl，复合体)相对分子质量约25万，含有9~10种不同的蛋白质，包括细胞色素b、cl和铁硫蛋白，催化电子从还原型泛醌转移到细胞色素c。②复合物Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)58④复合物Ⅳ(细胞色素氧化酶)相对分子质量约16万～17万，哺乳动物线粒体细胞色素氧化酶至少含有13种不同的蛋白质，包括细胞色素aa3和含铜蛋白，催化电子从还原型细胞色素c传递给分子氧。④复合物Ⅳ(细胞色素氧化酶)596.2.2.2呼吸链中各种传递体的排列顺序①根据各种组分的标准氧化还原电位来确定。标准氧化还原电位越小，其还原性越强，容易被氧化；标准氧化还原电位越大，其氧化性越强，容易被还原。呼吸链中各种组分的排列顺序是由低电位依次向高电位排列。6.2.2.2呼吸链中各种传递体的排列顺序60基础生物化学生物氧化61②根据在有氧条件下氧化反应达到平衡时各种传递体的还原程度来确定。Chance和Williams使用分光光度法测定离体的线粒体在有氧条件下TCA反应达到平衡时，呼吸链中各种传递体的还原程度。反应达到平衡时从底物到氧的各种传递体的还原程度是递减的，底物的最高，氧最低。②根据在有氧条件下氧化反应达到平衡时各种传递体的还原程度来确62好象物理学上的联通管，若进水量等于出水量，即流量达到平衡时，离进水口最近的水管中水位最高，离出水管最近的水管中水位最低，从进水管到出水管水位逐渐减低，若把水流视为电子流，就是此情况。好象物理学上的联通管，若进水量等于出水量，即流量达到平衡时，63③使用特异的抑制剂特异的抑制剂能阻断呼吸链中的特定环节，阻断部位的底物一侧的各种传递体应为还原型，阻断部位的氧一侧的各种传递体应为氧化型。③使用特异的抑制剂64表中可见FP、Cytb位于抗霉素A阻断部位之前，Cytc、cl、aa3位于阻断部位之后。用不同的抑制剂作此实验，就可以确定呼吸链中各种传递体的排列顺序。使用抗霉素A前后递电子体的还原型百分数表中可见FP、Cytb位于抗霉素A阻断部位之前，Cytc65④在体外实验中，将线粒体分成各种复合物，检测其各自催化的反应，再将其重组，检测其催化能力。美国格林(Green)等实验室成功地将呼吸链分离成具有催化活性的四种复合物以及CoQ和Cytc。将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ这四种复合物1：1：1：1的比例混合，加上CoQ和Cytc重组，基本上恢复了线粒体原有的催化能力。④在体外实验中，将线粒体分成各种复合物，检测其各自催化的反应66借助上述实验方法，呼吸链各组分的排列顺序已基本明确，但仍有些不一致的看法，其中以CoQ至细胞色素C以及Fe-S和CoQ的定位和数量也有争议。借助上述实验方法，呼吸链各组分的排列顺序已基本明确，但仍有些676.2.2.3呼吸链在脱氢酶催化下底物AH2脱下的氢交给NAD生成NADH，在NADH脱氢酶作用下，NADH将两个氢原子传递给FMN生成FMNH2，再将氢传递至CoQ生成CoQH2，此时2个氢原子解离成2H++2e，2H+游离于介质中，2e经Cytb、c1、c、aa3传递，最后将2e传递给1/2O2，生成O2-，O2-与介质中游离的2H+结合生成水。6.2.2.3呼吸链68

琥珀酸在脱氢生成的FADH2，将氢传递给CoQ，生成CoQH2，此后的传递和NADH氧化呼吸链相同。琥珀酸在脱氢生成的FADH2，将氢传递给CoQ，生成C69

线粒体中物质代谢会生成大量的NADH和FADH2，它们可来自丙酮酸氧化脱羧、TCA、脂肪酸的β-氧化和L-谷氨酸的氧化脱氨等反应。线粒体中物质代谢会生成大量的NADH和FADH2，它们70基础生物化学生物氧化716.2.3电子传递抑制剂电子传递抑制剂能够在呼吸链某一特定部位阻断电子传递。6.2.3电子传递抑制剂72①鱼藤酮(rotenone)鱼藤酮是一种极毒的植物毒素，用作杀虫剂，它抑制复合物Ⅰ，阻断电子由NADH→CoQ的传递，但不影响FADH2→CoQ的氢传递。安密妥(amytal)、杀粉蝶菌素A(piericidinA)等与鱼藤酮作用位点相同。①鱼藤酮(rotenone)73②抗霉素A(antimycinA)抗霉素A是从灰色链球菌分离出的一种抗菌素，抑制复合物Ⅲ的电子传递作用。③氰化物、叠氮化物、CO和H2S这些抑制剂均阻断细胞色素aa3至O2的电子传递，其中CN-和N3-与氧化型Cytaa3(Fe3+)有高度亲和力，CO则与还原型Cytaa3(Fe2+)形成复合物。②抗霉素A(antimycinA)746.3氧化磷酸化6.3.1氧化磷酸化的概念及类型ATP几乎是生物组织细胞能够直接利用的唯一能源，在糖、脂类及蛋白质等物质氧化分解中释放出的能量，相当大的一部分能使ADP磷酸化成为ATP，从而把能量保存在ATP分子内。生物体内通过生物氧化合成ATP的方式有底物水平磷酸化和氧化磷酸化。6.3氧化磷酸化75①底物水平磷酸化(substratelevelphospharylation)底物分子中的能量直接以高能键形式转移给ADP生成ATP，这个过程称为底物水平磷酸化。①底物水平磷酸化(substratelevelphosp76②氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)氧化磷酸化是需氧生物合成ATP的主要途径。氧化是底物脱氢或失电子的过程，磷酸化是ADP与Pi合成ATP的过程。在结构完整的线粒体中氧化与磷酸化这两个过程是紧密地偶联在一起的，即氧化释放的能量用于ATP合成，这个过程就是氧化磷酸化，氧化是磷酸化的基础，而磷酸化是氧化的结果。②氧化磷酸化(oxidativephosphorylati77电子从NADH或FADH2经电子传递链传递到分子氧形成水，同时偶联ADP磷酸化生成ATP，称为电子传递偶联的磷酸化或氧化磷酸化。电子从NADH或FADH2经电子传递链传递到分子氧形成水，同786.3.2氧化磷酸化与电子传递的偶联6.3.2.1P/0值测定P/O是指每消耗一个氧原子(或每对电子通过呼吸链传递至氧)所产生的ATP分子数。NADH经呼吸链完全氧化时测得的P/O比值为3；FADH2完全氧化时测得的P/O比值为1.5。6.3.2氧化磷酸化与电子传递的偶联79

在一密闭的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧饱和的缓冲液，再加入线粒体制剂时就会有氧化磷酸化进行。反应终了时测定O2消耗量(可用氧电极法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以计算出P/0值了。在一密闭的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧饱和的806.3.2.2电子传递过程的能量变化电子沿呼吸链由低电位流向高电位是个逐步释放能量的过程。根据氧化还原电位计算电子传递释放的能量是否能满足ATP合成的需要。电子在两个传递体间传递转移时，氧化还原电位差(

E

')与自由能的变化(

G

')间的关系为：

G

'=-nF

E

'（n为反应中电子转移数目，F为法拉弟常数）6.3.2.2电子传递过程的能量变化811molATP水解生成ADP与Pi所释放的能量为30.5kJ·mol-1

，凡氧化过程中释放的能量大于30.5kJ·mol-1

，均有可能生成1molATP，即可能存在一个偶联部位。根据

G

'=-nF

E

'

，当n=2时，

E

'=0.1583V时可释放30.5kJ·mol-1能量，所以反应底物与生成物的标准氧化还原电位的变化大于0.1583V的部位均可能存在着一个偶联部位。1molATP水解生成ADP与Pi所释放的能量为30.582基础生物化学生物氧化83在NAD→CoQ，Cytb→Cytc和Cytaa3→O2处可能存在着偶联部位。这是反应处在热力学平衡状态，温度为25℃，pH=7.0，反应底物和产物的浓度均为1mol计算的，这种条件在体内是不存在的。因此这一计算结果只能供参考。在NAD→CoQ，Cytb→Cytc和Cytaa3→O284根据NADH和FADH2经电子传递过程中的能量计算，释放的能量大大多于实测P/O比合成ATP数所需的能量，因此氧化磷酸化是可以进行的，即1molNADH经呼吸链氧化可偶联产生2.5molATP，而FAD则为1.5molATP。根据NADH和FADH2经电子传递过程中的能量计算，释放的能85根据G

‘=-nF

E

’也可算出电子从NADH和FADH2传递到O2时氧化磷酸化的贮能效率。NADH+2.5ADP+2.5Pi+1/2O2→NAD+4H2O+2.5ATP放能反应

NADH+1/2O2→NAD+H2O

G

'=-nF

E

'=-220.07kJ·mol-1合成ATP的吸能反应2.5ADP+2.5Pi→2.5ATP+3H2O

G

'

=76.25kJ·mol-1贮能效率：76.25/220.07×100％=34.7％根据G‘=-nFE’也可算出电子从NADH和FAD86呼吸链中电子传递和磷酸化的偶联部位呼吸链中电子传递和磷酸化的偶联部位871分子葡萄糖经EMP-TCA彻底氧化，共生成32个ATP，葡萄糖燃烧时释放的总能量为-2876.5kJ·mol-1，贮能效率则为：32×30.5/2876.5×100％=33.9％1分子葡萄糖经EMP-TCA彻底氧化，共生成32个ATP，葡886.3.3氧化磷酸化的机理在NADH和FADH2的氧化过程中，电子传递是如何偶联磷酸化的机理还不完全清楚。50年代Slater及Lehninger提出了化学偶联学说，1964年Boyer又提出了构象变化偶联学说，但都缺乏实验依据。而多数人支持英国生化学家P.Mitchell于1961年提出的化学渗透学说(chemiosmotichypothesis)，1966年完善了这一学说。因此而获得1978年的诺贝尔化学奖。6.3.3氧化磷酸化的机理896.3.3.1线粒体偶联因子F1-F0ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化合成的。ATP合酶可利用电子传递的高能状态将ADP和Pi合成为ATP。在电镜下可见到线粒体内膜基质侧有许多的球状颗化偶联因子，其中包含ATP合酶系统，ATP合酶是一个膜蛋白质复合体，主要由疏水的F0和亲水的F1组成，又称F1-F0-ATPase复合物或ATP合酶。6.3.3.1线粒体偶联因子F1-F090F1是它的球形头部，伸入到线粒体基质中，由五种亚基组成(

3

3

)，是合成ATP的催化部分。

与

亚基上有ATP结合部位；

亚基被认为具有控制质子通过的闸门作用；

亚基是F1与膜相连所必需，其中中心部分为质子通路；

亚基是酶的调节部分。F1是它的球形头部，伸入到线粒体基质中，由五种亚基组成(391F0横贯线粒体内膜，主要构成质子通道，由十多种亚基组成。位于F1与F0之间的柄含有寡霉素敏感性蛋白(oligomycinsensitivityconferringprotein,OSCP)，参与调控F1-F0的功能。F0横贯线粒体内膜，主要构成质子通道，由十多种亚基组成。位于926.3.3.2化学渗透学说(chemiosmotichypothesis)化学渗透学说认为在电子传递与ATP合成之间起偶联作用的是质子电化学梯度。①呼吸链中的电子传递体在线粒体内膜中有着特定的不对称分布，递氢体和电子传递体是间隔交替排列的，催化反应是定向的。即在传递电子过程中释放的能量不断将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜。6.3.3.2化学渗透学说(chemiosmotichy93基础生物化学生物氧化94②电子传递过程中复合物I、Ⅲ和Ⅳ中的递氢体起质子泵的作用，将H+从线粒体内膜基质侧定向地泵至内膜外侧空间，而将电子(2e)传给其后的电子传递体。②电子传递过程中复合物I、Ⅲ和Ⅳ中的递氢体起质子泵的作用，将95③线粒体内膜对质子透性很低，使泵到内膜外侧的H+积累，造成线粒体内膜两侧的质子梯度，即跨膜电位。由于线粒体内膜两侧H+浓度不同，内膜两侧还有一个pH梯度，底物氧化过程中释放的自由能就储存于跨膜电位和pH梯度中。这种跨膜的质子电化学梯度就是推动ATP合成的动力，称为质子推动力。③线粒体内膜对质子透性很低，使泵到内膜外侧的H+积累，造成线96基础生物化学生物氧化97④线粒体F1-F0-ATPase复合物利用ATP水解能量将H+泵出内膜。当有足够高的跨膜质子电化学梯度时，强大的H+流通过F1-F0-ATPase进入线粒体基质时，释放的能量推动ATP合成。④线粒体F1-F0-ATPase复合物利用ATP水解能量将H98因此，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度。每对H+通过F1-F0-ATPase回到线粒体基质中可以生成1分子ATP。以NADH作底物，其电子沿呼吸链传递在线粒体内膜中形成3个回路，所以生成3分子ATP。以FADH2为底物，其电子沿琥珀酸氧化呼吸链传递在线粒体内膜中形成2个回路，所以生成2两个ATP分子。因此，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H99基础生物化学生物氧化100基础生物化学生物氧化1016.3.3.3氧化磷酸化的重建E.Racker等用重组实验证明了氧化磷酸化的偶联机制。用超声波处理线粒体制备亚线粒体泡，使原来朝向基质一侧的内膜翻转朝外，但仍保留了进行氧化磷酸化的功能。再用胰蛋白酶或尿素处理，将它分成可溶性的ATP酶和膜囊泡，这两部分都丧失了氧化磷酸化功能。6.3.3.3氧化磷酸化的重建102再用胰蛋白酶或尿素处理，将它分成可溶性的ATP酶和膜囊泡，这两部分都丧失了氧化磷酸化功能。再用胰蛋白酶或尿素处理，将它分成可溶性的ATP酶和膜囊泡，这103膜囊泡保留了传递电子的功能但不能使ADP磷酸化。若将可溶性的F1再加回到只有F0的膜囊泡中，氧化磷酸化作用又行恢复。氧化磷酸化重建实验证明了呼吸链和F1-F0-ATPase的结构与作用机理。膜囊泡保留了传递电子的功能但不能使ADP磷酸化。若将可溶性的1046.3.3.4ATP酶的旋转催化理论化学渗透学说并没有解决ATP合酶如何利用质子推动力催化ADP与Pi形成ATP。美国人Boyer.P.D.发现ATP合酶上ADP+Pi生成ATP无须消耗能量，而从酶上将ATP释放出来要消耗能量。因此于1964年提出“构象偶联假说”，经过20多年的充实修正，创立了“旋转催化”模型，得到许多实验证据的有力支持，基本上阐明了ATP合酶的催化机制。6.3.3.4ATP酶的旋转催化理论105Walker研究了ATP头部的精细结构，支持了Boyer的模型，二人因此获得1997年诺贝尔化学奖。“旋转催化”认为，F1-F0-ATPase头部

3

3构成3个催化部位，中部的

亚基在质子推动力驱动下相对于

3

3作旋转运动。由于3个

亚基与

亚基的不对称接触，分别处于不同的状态，即无核苷酸结合的空置状态(O)，结合ADP+Pi的松散结合状态(L)和结合ATP的紧密结合状态(T)。Walker研究了ATP头部的精细结构，支持了Boyer的模106当质子推动力驱使H+经F0质子通道进入时，F0组分质子化而发生构象改变，积累足够的扭矩力推动

相对于

3

3旋转120°。使处于T态的催化部位释放ATP变为O态，同时L态催化部位上生成ATP变为T态，O态结合ADP+Pi变为L态。当质子推动力驱使H+经F0质子通道进入时，F0组分质子化而发107基础生物化学生物氧化108基础生物化学生物氧化109质子流通过F0引起亚基Ⅲ寡聚体和

亚基一起转动。这种旋转配置

/亚基之间的不对称的相互作用，引起催化位点性质的转变。

亚基的中心

-螺旋是转子，亚基I和Ⅱ与

亚基和在一起组成定子，它压住

/异质六聚体。质子流通过F0引起亚基Ⅲ寡聚体和亚基一起转动。这种旋转配110基础生物化学生物氧化1116.3.3.5腺苷酸的转运氧化磷酸化进行的条件是有氧、ADP、底物和电子传递。通常细胞中有足够的Pi，ADP通常控制细胞的氧化磷酸化。细胞内的ATP主要在线粒体内生成，ATP在线粒体外被利用后又变为ADP。由于ADP和ATP都不能自由地穿过线粒体内膜，因而必须有一种机制将线粒体外的ADP运入，同时把ATP运到线粒体外。6.3.3.5腺苷酸的转运112线粒体内膜上的腺苷酸载体进行ADP/ATP的双向运输，又称ADP/ATP交换体。ADP/ATP交换体是高度选择性的传递蛋白，以二聚体的形式嵌入内膜，在跨膜电位(外正、内负)的推动下把ADP运入基质，同时将ATP运到膜外侧。腺苷酸载体二聚体只有一个腺苷酸结合位点，面向膜外侧时结合位点对ADP有高亲和力，对苍术苷的抑制敏感；面向膜内侧的位点对ATP有高亲和力，对米酵霉酸的抑制敏感。线粒体内膜上的腺苷酸载体进行ADP/ATP的双向运输，又称A1136.3.4氧化磷酸化的解偶联和抑制在研究氧化磷酸化中间步骤时，可利用某些物质将氧化磷酸化过程分解成若干个反应阶段。根据这些物质的作用方式不同分为3类：解偶联剂、氧化磷酸化抑制剂和离子载体抑制剂。6.3.4氧化磷酸化的解偶联和抑制1146.3.4.1解偶联剂(uncoupler)解偶联剂可使电子传递与ADP磷酸化两个过程分离，它只抑制ATP的形成过程，而不抑制电子传递过程，使电子传递所产生的自由能以热的形式耗散。解偶联剂使电子传递失去正常的控制，造成过分的氧和底物消耗，而能量却得不到贮存。6.3.4.1解偶联剂(uncoupler)115解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+的跨膜梯度，因而无ATP生成。2,4-二硝基苯酚(dinitrophenol，DNP)在pH7的环境中以解离形式存在，不能透过线粒体膜。在酸性环境中，解离的DNP质子化，变为脂溶性的非解离形式，因而容易透过膜，同时将一个质子从膜外侧带入膜内，这样就破坏了电子传递形成的跨膜的质子电化学梯度，抑制了ATP的形成。解偶联剂只抑制电子传递链磷酸化，不影响底物水平磷酸化。解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+的116解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化，动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶联蛋白，使氧化磷酸化处于解偶联状态，这对于维持动物的体温十分重要。DNP、羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)、双香豆素(dicoumarin)，过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化，动物棕色脂肪1176.3.4.2氧化磷酸化抑制剂氧化磷酸化抑制剂同时抑制氧的吸收利用和ATP的形成，却不直接抑制电子传递链上载体的作用。这种抑制剂的作用方式是直接干扰ATP的生成过程，即干扰由电子传递的高能状态形成ATP的过程，结果也使电子传递不能进行。6.3.4.2氧化磷酸化抑制剂118寡霉素(oligomycin)可与F1的OSCP结合，阻塞氢离子通道，从而抑制ATP合成。二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)可与F0的DCC结合蛋白结合，阻断H+通道，抑制ATP合成。栎皮酮(quercetin)直接抑制参与ATP合成的ATP酶。寡霉素(oligomycin)可与F1的OSCP结合，阻塞氢1196.3.4.3离子载体抑制剂(ionophore)离子载体抑制剂是一类脂溶性物质，能插入线粒体内膜的脂双层，又能与某些离子相结合，并作为离子的载体使这些离子能够穿过膜。它们与解偶联剂的区别在于所结合的是质子以外的其他一价阳离子。6.3.4