分子生物学第三讲

分子生物学分子生物学DNA复制DNAReplication1分子生物学分子生物学DNA复制1类型α–螺旋(α–helix)β－折叠(β－pleatedsheet)β－转角(β－turn)无规卷曲(randomcoil)Ω环蛋白质的二级结构是指多肽链主链的折叠和盘绕方式。二级结构的基本单位蛋白质的一级结构是指以肽键相连的肽链中氨基酸的排列顺序Reviewoflastclass2类型α–螺旋(α–helix)β－折叠超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指二级结构的基本结构单位（α-螺旋，β-折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。已知的超二级结构主要有αα，βxβ，β-曲折和β-折叠筒等。βxβ：是两段平行的β-折叠通过一段连接链x连接而形成的结构。如x为α-螺旋则为βαβ；最常见的为两个βαβ聚集体连在一起形成βαβαβ结构，称Rossmann折叠。3超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指β-曲折（β-meander）：是三条或三条以上反平行的β-折叠通过短链，如β-转角相连。4β-曲折（β-meander）：是三条或三条以上反平行的β-β-折叠筒（β-sheetbarrel）：

由多个β-折叠片卷成一个圆筒状的结构。5β-折叠筒（β-sheetbarrel）：mRNA：messengerRNA信使RNAtRNA：transferRNA转运RNArRNA：ribosomalRNA核糖体RNARNA的种类复性：退火处理(慢速冷却)使得互补链互相配对,恢复双链结构退火（Annealing):

DNA由单链复性变成双链结构的过程杂交（Hybridization):

不同核酸链之间的互补部分的复性6mRNA：messengerRNA信使RNARNA减色效应:核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象。增色效应:由于核酸变性而引起紫外吸收增加的现象。Strongacid+hightemperature:completelyhydrolyzedtobases,riboses/deoxyrobose(核糖/脱氧核糖),andphosphateHighpH(>7-8)hassubtle(small)effectsonDNAstructureHighpHchangesthetautomeric(互变异构)stateofthebases.RNAisunstableathigherpH（DNase）（RNase）核酸外切酶核酸内切酶作用方式底物Endofreview7减色效应:核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸复性而引起紫外88双脱氧链终止法3’-TAGCACGATACTGTC-5’5’-ATCGTGCTATGACAG-3’9双脱氧链终止法3’-TAGCACGATACTGTC-5’5’DNA复制DNAReplication10DNA复制10教学要求:1.理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制2.掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质3.掌握真核生物DNA复制的特点4.掌握DNA复制的类型11教学要求:1.理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制11DNAReplication:AnOverviewSemi-conservativemechanism(半保留机制)Replicons(复制子),origins(复制起始点)andtermini(复制终点)semi-discontinousreplication(半不连续复制)RNApriming(RNA引导)12DNAReplication:AnOverviewSeSemi-conservativemechanism(半保留机制)

DNA双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条子链Duringreplication,thetwoparentalstrandsseparateandeachactsasatemplatetodirecttheenzyme-catalyzedsynthesisofanewcomplementarydaughterstrandfollowingthenormalbase-pairingrules.13Semi-conservativemechanism(半亲代DNA子代子代半保留复制新合成的链14亲代DNA子代子代半保留复制新合成1415Nlabelingexperiment15NlabeledDNAunlabeledDNA1515Nlabelingexperiment15Nlab1616DNA半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。17DNA半保留复制的生物学意义：17Replicon

isanypieceofDNAwhichreplicatesasasingleunit.Itcontainsanoriginandsometimesaterminus.能进行复制的DNA单位，从起始位点到终止位点的全部DNA.Replicon复制子

Origin(复制起始位点)istheDNAsequencewherearepliconinitiatesitsreplication.A-Trich.Terminus(复制终止点)istheDNAsequencewherearepliconusuallystopsitsreplication18RepliconisanypieceofDNAwProkaryoticgenome原核基因组:singlecircularDNA=singlerepliconEukaryoticgenome真核基因组:multiplelinearchromosomes&multiplerepliconsoneachchromosome19Prokaryoticgenome原核基因组:sin

细菌和真核生物复制的比较生物复制子数复制子长度复制速率细菌（E.coli）14,200Kb50Kb/min酵母（S.cerevisiae）50040Kb3.6Kb/min果蝇（D.melanogaster）3,50040Kb2.6Kb/min爪蟾（X.laevis）15,000200Kb500bp/min小鼠（M.musculus）25,000150Kb2.2Kb/min植物（V.faba）35,000300Kb

20

细菌和真核生物复制的比较生物复制子数复制子长度复制速率细菌Bidirectional

replicationofacircularbacterialreplicon

Allprokaryotic(原核的)chromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecircularandcomprisesinglereplicon.Theoriginisacomplexregion

wheretheinitiationofDNAreplicationandthecontrolofthegrowthcycleoftheorganismareregulated21Bidirectionalreplicationofa萤光素酶报告基因载体22萤光素酶报告基因载体22Bidirectionalreplication(双向复制)

ofacircularbacterialrepliconorignterminaldaughterDNAAsingleterminationsiteisroughly180ooppositetheuniqueorigin23Bidirectionalreplication(双向复Thelong,linearDNAmoleculesofeukaryoticchromosomesconsistofmutiplereplicons,eachwithitsownorgin.Atypicalmammaliancellhas50000-100000repliconswithasizerangeof40-200kb.

When

replicationforks(复制叉)

fromadjacent

replicationbubbles(复制泡)

meet,theyfusetoformthecompletelyreplicatedDNA.Multiple

eukaryoticreplicons

andreplicationbubbles24Thelong,linearDNAmoleculesreplicationforks(复制叉):在复制启动时，尚未解开螺旋的亲代双链同新合成的两条子代双链DNA的交界处。replicationbubbles(复制泡)：两个靠得很近的复制叉之间形成的空间。25replicationforks(复制叉):在复制启动时originsofDNAreplication(every~150kb)replicationbubbledaughterchromosomesfusionofbubblesbidirectionalreplicationOriginsofDNAreplicationonmammalianchromosomes5’3’

3’5’

5’3’3’5’

3’5’

5’3’

26originsofDNAreplication(evsemi-discontinousreplication

(半不连续复制)5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’LeadingstrandLaggingstrandOkazakifragment半不连续复制27semi-discontinousreplication

半不连续复制概念：

在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’5’方向的母链作为模板指导新的链以5’3’方向连续合成，另一股以5’3’为方向的母链则指导新合成的链以5’3’方向合成1000-2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。28

28Leadingstrand（前导链）：Theleadingstrandismadecontinuouslyina5’3’directionfromtheorigin.DNA复制时，一股以3’5’方向的母链作为模板，指导新合成的链以5’3’方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）

29Leadingstrand（前导链）：29Laggingstrand（后随链):

Thelaggingstrandisinitiatedatthereplicationforkandproceeds5’3’backtowardstheorigintoformthefirstOkazakifragment.

DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’3’合成1000—2000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链，由岗崎等人在1968年发现。（复制方向与解链方向相反)30Laggingstrand（后随链):303131又叫双螺旋稳定蛋白。

当解旋酶将双链打开以后，单链DNA具有一种潜在的恢复原来双链的能力，重新形成氢键。而且单链本身若有反向重复也会形成发夹结构，这两种情况都会影响复制的，但SSB可以解决这一问题。SSB并不是酶，是由177个aa组成的蛋白，E.coli的SSB以四聚存在，分子量为74KDa，结合在单链上，使DNA受到保护，不被酶水解，也不回复成双链，因此可以降低DNA的Tm值。SSB对于细菌复制叉的结构的作用和解旋酶是同等的。单链结合蛋白singlestrandbindingprotein,SSB32又叫双螺旋稳定蛋白。单链结合蛋白32岗崎片段（Okazakifragment）：

DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’3’合成1000—2000个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。

33岗崎片段（Okazakifragment）：331、对酵母、细菌以及几种生活在真核生物细胞中的病毒来说，都可在DNA独特序列（）处观察到复制泡的形成。复制起点2、帮助DNA解旋的（）与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。单链DNA结合蛋白(SSB)3、在DNA复制过程中，连续合成的子链称()，另一条非连续合成的子链称为()。前导链后随链4、在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为()．DNA连接酶5、DNA后随链合成的起始要一段短的()，它是由()以核糖核苷酸为底物合成的。RNA引物DNA引发酶6、在前导链上DNA沿5’→3’方向合成，在后随链上则沿3’→5’方向合成。（）341、对酵母、细菌以及几种生活在真核生物细胞中的病毒来说，都可DNA复制反应的共同特点半保留复制半不连续复制有特定的复制起点需要引物复制真实性复制叉双向移动，DNA合成的单向延伸，5’3’

35DNA复制反应的共同特点半保留复制35ProteinsandenzymesofDNAreplicationDNAhelicase(DNA解旋酶)single-strandbindingprotein(SSB,单链结合蛋白)DNAprimase(DNA引发酶)DNAtopoisomerase(拓扑异构酶)Primosome(引发体)DNApolymerase(DNA聚合酶)DNAligase(DNA连接酶)36ProteinsandenzymesofDNAreDNAhelicase(DNA解旋酶)UsetheenergyofATPhydrolysistomoveintoandmeltdouble-strandedDNA

利用ATP供能，解开DNA双链,可随复制叉的伸展向前移动37DNAhelicase(DNA解旋酶)Usethee大肠杆菌中解旋酶的种类种类功能DnaA辨认起始点，并结合到复制起始部位DnaB解开DNA双链DnaC运送和协同DnaB38大肠杆菌中解旋酶的种类种类功能DnaA辨认起始点DNAprimase(DNA引发酶)SynthesizesashortRNAprimertoinitiatesynthesisofDNA

在模板复制的起始部位，以DNA为模板催化互补碱基聚合生成一小段RNAe.g.DNaG(E.coli)39DNAprimase(DNA引发酶)SynthesiDNAtopoisomerase(拓扑异构酶)RegulatethelevelofsupercoilingofDNAmoleculesTopoisomeraseII:breakbothstrandsofDNAbythetransferofanotherdouble-strandedsegmentthroughthebreak.切断两条链而改变拓扑结构的酶。如：存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。TopoisomeraseI:breakonestrandoftheDNAbypassingtheotherstrandthroughthebreak.切断一条链而改变拓扑结构的酶，如：大肠杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closingenzyme，分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的）。40DNAtopoisomerase(拓扑异构酶)Regul

核酸外切酶活性3´→5´外切酶活性：切除错配的核苷酸5´→3´外切酶活性：切除引物切除突变的片段？413´→5´外切酶活性：5´→3´外切酶活性：？41

DNAligase

makethefinalphosphodiesterbondbetweenthefragments连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。ATP42DNAligasDNA复制的方式

1、θ型复制2、滚环复制3、D环复制43DNA复制的方式1、θ型复制43θ型复制(Thetareplication)在原核生物中发现的一种DNA复制机制。复制是在环形DNA分子某一点(复制起始点)上开始的。当复制围绕着染色体的两个方向进行时，所形成的复制泡状物延续生长。44θ型复制(Thetareplication)是噬菌体中常见的DNA复制方式。滚环复制的特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口(nick)，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。

滚环复制(Rollingcirclereplication)释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制成双链环状DNA分子。45是噬菌体中常见的DNA复制方式。滚环复制(Ro滚环复制模型1968年Gilbert提出：模板链和新合成的链分开;不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸只有一个复制叉;单向复制的特殊方式46滚环复制模型1968年Gilbert提出：46

又称取代环复制。双链在固定点解开进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代在电镜下看到呈英文字母D的形状。D环复制(D-loopreplication)47又称取代环复制。D环复制(D-loopreplSomeresearcherssayanage-oldcashcroplongthefocusofpublichealthdebatecouldbeusedtohelpsolvethenation'senergycrisis,bygeneticallymodifyingthetobaccoleafforuseasabiofuel.48Someresearcherssayanag碳中立:通过使用可再生能源，或者利用碳减排设施，使排放到空气中的二氧化碳总量和从大气中移除的二氧化碳总量达到平衡的实践。49碳中立:通过使用可再生能源，或者利用碳减排设施，使排放到空5050515152525353HT:Herbicidetolerant54HT:Herbicidetolerant545555SoybeansGMproductionarea2008:65.8millionhectaresshareofproduction2008:70%

ARomanianfarmershowsgeneticallymodifiedsoybeans.56Soybeans56Corn/MaizeGMproductionarea2008:37.3millionhectares

Shareofproduction2008:24%

AMexicanfarmercutsgeneticallymodifiedcorninCapulalpan.GrowingtransgeniccornhasbeenillegalinMexicosince1998,butfarmerssaytheyreceivedGM-cornfromagovernmentprogram.57Corn/Maize57CottonGMproductionarea2008:15.5millionhectares

Shareofproduction2008:46%

ASouthAfricancottonfarmershowsoffageneticallyengineeredcottonplant.Some90percentofthe3,000small-scalecottonfarmersintheareausetheinsect-resistantBtcottonvariety.TheGMcottonisresistanttothecottonbollwormpest,becauseitproducesanaturally-occurringpesticide.

58Cotton58Canola/Rapeseed

GMproductionarea2008:5.9millionhectares

Shareofproduction2008:20%

Frenchfarmworkersleaderandanti-GMactivistJoseBovecutsGMcanolainafieldnearthetownofBelpuech.

CanolaisfourthintheworldleagueofGMcrops.Allgeneticallymodifiedvarietiesareherbicideresistant.Thecropismainlyusedforbiofuelproduction.CountriesgrowingitcommerciallyareAustralia,theUnitedStates,andCanada.59Canola/Rapeseed

GMproductionGMproductionworldwide2008:experimental.

Shareofproduction2008:n.a.

GeneticallymodifiedGoldenRiceisgrowingattheInternationalRiceResearchInstitute(IRRI)inLosBanos,Manila.GoldenRicehasbeendevelopedbySwissscientiststofightVitaminAdeficiency.Thericecontainsagenethatallowstheplanttoproducebeta-carotene,aprecursorofVitamin-A.60GMproductionworldwide2008:Papaya

GMproductionarea2008:6,500hectares.

Shareofproduction2008:n.a.GreenpeaceactivistsdumpthousandsofpapayasinfrontofThailand'sDepartmentofAgricultureinBangkok.TheprotestswereincitedbythespreadofillegalGMpapayainThailand.Since1998,GMpapayasresistanttotheringspotvirushavebeencultivatedinHawaiiandChina.Criticssaytheproteinusedtomakepapayasvirus-resistantisapotentialallergen.61Papaya

GMproductionarea200Cowpea

GMproductionworldwide2008:experimental

Shareofproduction2008:n.a.

AresearcherinthebiotechnologylaboratoryoftheNigeria-basedInternationalInstituteofTropicalAgriculture(IITA)isolatesgenesfromtheprotein-richcowpeaplant.ProjectstofurtherenhancetheirnutritionalcontentareunderwayinAfrica.

Sofar,nomajorAfricanfoodcrophasreceivedGMmodification.ResearchersattheIITAestimate,however,thatbiotechnologycouldhelpmakeAfricaself-sufficientwithin10years.62Cowpea

GMproductionworldwidAlfalfa

GMproductionarea2008:100,000hectares

Shareofproduction2008:n.a.

AworkercollectsalfalfaatCuatroCienegas,Mexico.Alfalfaismostlyusedascat