分子生物学第六章基因重组

分子生物学第六章-基因重组2024/4/1分子生物学第六章基因重组分子生物学第六章-基因重组2024/4/1分子生物学第六章基1遗传重组重组recombination:是已存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组：离散的染色体混合时产生新的组合。如真核染色体减数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。分子内或染色体内重组：通过DNA的剪切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。分子生物学第六章基因重组遗传重组重组recombination:是已存在的遗传物质2分子内重组同源重组homologicalrecombination：同源性依赖，非序列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。位点特异性重组sitespecificrecombination：序列专一性依赖，非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。转座transposition：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非特异。不正常重组或非常规重组illegitimaterecombination：很少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加工。与癌症相关。人工重组artificialrecombination:体外进行DNA的剪切和连接引起的重组，即基因重组。分子生物学第六章基因重组分子内重组同源重组homologicalrecombina3一、同源重组功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因导入模型：拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模板。如DNA修复。断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链间断裂、交换和重新连接。如减数分裂时染色体交换杂合模型：包括上面两种特征。分子生物学第六章基因重组一、同源重组功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌4修复损伤DNA的同源重组分子生物学第六章基因重组修复损伤DNA的同源重组分子生物学第六章基因重组5真核生物同源重组的断裂与重接模型

DarlingtongD.C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重节，以消除张力，从而产生重组。证据：姊妹染色单体的交换

分子生物学第六章基因重组真核生物同源重组的断裂与重接模型Dar6Diploideukaryotes:crossingover(双倍体染色体交换)Homologouschromosomeslineupinmeiosis(when)Thenonsisterchromatidsexchangeequivalentsections(what)分子生物学第六章基因重组Diploideukaryotes:crossingo7同源重组发生在两条DNA双链之间重组酶能以任何的同源序列为底物重组的频率在整组基因中并不很频繁，但对整体和局部都有影响重组的总频率在精子和卵子中并不相同，在人类中女性是男性的两倍在整组基因内部，同源重组的频率与染色体的构象有关，例如，十字结构将阻止附近的DNA重组变异。分子生物学第六章基因重组同源重组发生在两条DNA双链之间分子生物学第六章基因重组8染色体的重组包含部分的物理性的改变：破损与再联合细线期偶线期粗线期双线期终变期同化作用在DNA双链中制造一个破损两条DNA双链分子的联接作用是基因重组的关健环节分子生物学第六章基因重组染色体的重组包含部分的物理性的改变：破损与再联合细线期偶线期9同源染色体两对DNA双链在相应点产生nick，一条单链离开它的伙伴，与另一个双链分子的相应位置倒易位置，创造了两个DNA双链之间的连系，这种连接在一起的一对双链叫做交差分子。一个链与另一个链的连接点叫做重组关节。分子生物学第六章基因重组同源染色体两对DNA双链在相应点产生nick，一条单链离开它10重组关节能沿着DNA双链分子移动，这种移动叫做枝状迁移在一条链被另一条链取代的过程中，分叉点可以沿任一个方向移动分子生物学第六章基因重组重组关节能沿着DNA双链分子移动，这种移动叫做枝状迁移分子生11交差分子旋转后形成一个平面结构------Holliday结构分子生物学第六章基因重组交差分子旋转后形成一个平面结构------Holliday结12细菌基国重组中的单链同化作用

single-strandassimilationDNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同化。有三个必备条件：◆其中一个DNA分子必须有单链区◆其中一个DNA分子必须有自由3’端◆单链区和3’端必须设置在两分子互补区内分子生物学第六章基因重组细菌基国重组中的单链同化作用

single-strand13RecA催化单链的同化作用RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：◆RecA在单链DNA上慢慢聚合。◆单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异源双链连接◆单链从双链中慢慢转移，产生一个长的异源双链DNA区带。SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应分子生物学第六章基因重组RecA催化单链的同化作用RecA催化单、双链DNA的反应分14RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecAcatalyzessingle-strandassimilation分子生物学第六章基因重组RecApromotestheassimilation15RecA介导的DNA修复分子生物学第六章基因重组RecA介导的DNA修复分子生物学第六章基因重组16重组热点重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期产生，在联会丝复合物形成阶断消失(~60min)在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重组热点。分子生物学第六章基因重组重组热点重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期产生，在联会17Chi序列刺激它周围附近的重组与重组有关的基因称为Rec基因Rec突变体不能进行同源重组大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E.coli的Rec基因突变体鉴定Chi序列能刺激它周围附近的重组：5’GCTGGTGG3’3’CGACCACC5’Chi序列在大肠杆菌中每5—10kb出现一次Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。分子生物学第六章基因重组Chi序列刺激它周围附近的重组与重组有关的基因称为Rec基因18RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组中所起的作用便是提供带有自由3’端的单链DNA。分子生物学第六章基因重组RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在下，19分子生物学第六章基因重组分子生物学第六章基因重组20Haploidprokaryotes

(单倍体生物原核同源重组）BetweenthetwohomologousDNAduplex(where)partiallyduplicatedDNAofthechromosomebetweenchromosomalDNAand“foreign”DNANicksmadenearChi(GCTGGTGG/each4kb)sitesbyanucleasewithrecBCD.RecAbindstossDNAtoformRecA-ssDNA.How:Hollidaymodel

分子生物学第六章基因重组HaploidprokaryotesBetweenth213. RecA-ssDNAfilamentssearchtheoppositeDNAduplexforcorrespondingsequence(invasion).4. Sealthenicksandformafour-branchedHollidaystructure5. Branchmigration&resolvingHollidayjunctionHaploidprokaryotes

(原核同源重组）分子生物学第六章基因重组3. RecA-ssDNAfilamentssearch22Haploidprokaryotes

(原核同源重组）ResolvingHollidayjunction分子生物学第六章基因重组Haploidprokaryotes(原核同源重组）Re23二、位点专一性重组非序列同源性重组位点特异由识别特异重组位点的酶指导导致DNA序列发生重排举例：l噬菌体插入细菌基因组l噬菌体从细菌基因组中切离分子生物学第六章基因重组二、位点专一性重组非序列同源性分子生物学第六章基因重组24l-encodedintegrase(Int整合酶):makesstaggeredcuts交错切点inthespecificsites（15bpseq）IntandIHF(integrationhostfactorencodedbybacteria):recombinationandinsertionl-encodedexcisionase(XIS):excisionofthephageDNASite-specificrecombination:(位点专一性重组）bacteriophage

linsertion分子生物学第六章基因重组l-encodedintegrase(Int整合酶):25整合过程要求在attp和attB之间进行识别；而移除过程则需要在attL和attR之间进行识别重组过程是可逆的，但反应条件不同：整合反应需要int产物和IHF因子；移除反应还需要噬菌体xis基因产物。xis基因产物决定噬菌体是否进行复制分子生物学第六章基因重组整合过程要求在attp和attB之间进行识别；而移除过程则需26整合的过程:A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；B.Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间提，C.在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。分子生物学第六章基因重组整合的过程:A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int27位点专一性重组的核苷酸序列1.attP:POP’:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列；P为-160~O的160bp序列P’为O~80的80bp序列共240bp2.attB:BOB’:B为-11~O序列B’为O~11序列共23bp重组后形成BOP’(attL,91bp)和POB‘(attR,171bp)分子生物学第六章基因重组位点专一性重组的核苷酸序列1.attP:POP’:O为128特异性重组可以在体外进行特异性重组可以通过Int和IHF在体外进行，它包括在缺少任何DNA合成下的破损与再结合，两个臂的功能可以通过在两侧产生缺失来研究attp发挥作用要240bp，而attB只需要由-11到+11的23bp的片断即可发挥作用，在这个片段中，核心两侧只有4bp分子生物学第六章基因重组特异性重组可以在体外进行特异性重组可以通过Int和IHF在体29通路克隆系统

gatewaycloningsystem一种位点特异的DNA重组技术，包括LR和BP两个反应体系。可简单表示为：attBXattPattLXattR用途：PCR产物的定向克隆DNA片断高效、广泛的亚克隆氨基或羧基末端的融合蛋白表达分子生物学第六章基因重组通路克隆系统

gatewaycloningsystem一30LR反应和BP反应LR反应：通路克隆的主要反应,LR克隆酶(整合酶(Int)和整合宿主因子(IHF)蛋白)识别attL和attR重组位点后,催化入口克隆(entryclone)的外源DNA及其两端部分位点取代目标载体(destinationvector)的ccdB基因及其两端部分位点(灰色),形成表达克隆(expressionclone)。BP反应：与LR反应反向,

BP克隆酶混和物(Int、IHF和切除酶(Xis))催化表达载体attB间的目的基因转到供体载体中,形成新的入口克隆,此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。分子生物学第六章基因重组LR反应和BP反应LR反应：通路克隆的主要反应,LR克隆31PCR产物的BP反应分子生物学第六章基因重组PCR产物的BP反应分子生物学第六章基因重组32三、转座重组特点：1.自身携带有转座酶基因，末端有反向重复序列;2.转座过程中出现共联体；3.转座以后,可以造成原来转座子位置的DNA缺失(非复制转座)，也可以依然保持在原位，而在靶序列上复制了一个转座子(复制转座);4.转座完成以后可以在靶序列上造成同向重复序列5.转座子插入后可影响所在位置的基因的表达分子生物学第六章基因重组三、转座重组特点：分子生物学第六章基因重组33转座子转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列。插入位置与转座子序列没有相关性。病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中都含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。原核生物转座因子包括：插入序列；转座子；转座噬菌体分子生物学第六章基因重组转座子转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列。34ISelement分子生物学第六章基因重组ISelement分子生物学第六章基因重组35基因组的进化既赖于获得新的序列又赖于重排目前的序列。转座子可引起其它基因组顺序的重排，提供基因组里变异的主要来源。重排可以产生新的序列和改变目前序列的作用。细菌、噬菌体、病毒(尤其是逆转录病毒)可以通过传染传递遗传信息。分子生物学第六章基因重组基因组的进化既赖于获得新的序列又赖于重排目前的序列。分子生物36转座子的特征性结构是它的末端具有反向重复序列，而两侧宿主DNA的邻接末端是短的同向重复序列。当考查DNA序列时，这种结构类型是判断转座子的鉴别特征，并且是这种序列起源于转座作用的初步证据。分子生物学第六章基因重组转座子的特征性结构是它的末端具有反向重复序列，而两侧宿主DN37转座因子IS线型宿主DNA插入后引起目标序列产生同向重复分子生物学第六章基因重组转座因子IS线型宿主DNA插入后引起目标序列产生同向重复分子38Tn10插入环状DNA内Tn10再移动时可能从两个方向移动，产生新的转座子分子生物学第六章基因重组Tn10插入环状DNA内Tn10再移动时可能从两个方向移39Nonreplicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonthatleavesadonorsite(usuallygeneratingadouble-strandbreak)andmovestoanewsite.

Replicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonbyamechanisminwhichfirstitisreplicated,andthenonecopyistransferredtoanewsite.

复制转座非复制转座分子生物学第六章基因重组Nonreplicativetranspositiond40转座产生的效应Recombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem同向重复序列之间重组造成重复间序列缺失

分子生物学第六章基因重组转座产生的效应Recombinationbetweend41转座产生的效应Recombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.反向重复序列之间重组造成重复间序列倒位

分子生物学第六章基因重组转座产生的效应Recombinationbetweeni42Transpositionisinitiatedbynickingthetransposonendsandtargetsiteandjoiningthenickedendsintoastrandtransfercomplex.转座机制：在转座酶作用下，在转座子和目标序列的反式位点产生缺刻，转座子通过末端联会插入到目标序列中，形成共合体

分子生物学第六章基因重组Transpositionisinitiatedby43Transpositionmayfuseadonorandrecipientrepliconintoacointegrate共合体.Resolutionreleasestworeplicons复制子,eachcontainingacopyofthetransposon.复制转座：在共合体分解时转座子产生两个拷贝

缺刻重组复制分子生物学第六章基因重组Transpositionmayfuseadonor44断裂重接则造成非复制转座Nonreplicativetranspositionproceedsbybreakageandreunion分子生物学第六章基因重组断裂重接则造成非复制转座Nonreplicativetra45Eachcontrollingelementfamilyhasbothautonomousandnonautonomousmembers.Autonomouselementsarecapableoftransposition.Nonautonomouselementsaredeficientintransposition.Pairsofautonomousandnonautonomouselementscanbeclassifiedin>4families.Controllingelements控制因子inmaizeformfamiliesoftransposons

可用于转座子插入突变自主转座子非自主转座子分子生物学第六章基因重组Eachcontrollingelementfamil46Theroleoftransposableelementsinhybriddysgenesis杂种不育带有P因子P品系的精子DNA释放到卵细胞中时，精子基因组上的P因子被激活，发生转座，引起突变分子生物学第六章基因重组Theroleoftransposableeleme47TheretrovirallifecycleproceedsbyreversetranscribingtheRNAgenomeintoduplexDNA,whichisinsertedintothehostgenome,inordertobetranscribedintoRNA.Theretrovirus反转录病毒lifecycleinvolvestranspositionlikeeventsLTRisanabbreviationforlong-terminalrepeat.分子生物学第六章基因重组Theretrovirallifecycleproc48自然界中的其它

基因转移与重组现象一、接合作用(conjugation)二、转化(transformation)和转导(transduction)三、转染(transfection)四、免疫分子的多样性分子生物学第六章基因重组自然界中的其它

基因转移与重组现象一、接合作用49接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的方式。一、接合作用(conjugation)分子生物学第六章基因重组接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA50转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。二、转化(transformation)分子生物学第六章基因重组转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体51转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)分子生物学第六章基因重组转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞52三、转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。分子生物学第六章基因重组三、转染(transfection)转染是转化的一种特殊形式53思考题解释:recombination;single-strandassimilation;同源重组在生命活动和基因工程中的作用是什么?同源重组的断裂重接模型的基本内容是什么?(提示:考虑断裂和重接的机制)位点专一性重组有哪些主要特点?基因工程中是如何利用其原理进行基因克隆的?转座子的特征性结构是什么?转座可产生哪些的生物学或遗传学效应?自然界中存在哪些基因转移与重组现象?（至少写出5种以上）试比较同源重组、位点专一性重组、转座重组和人工重组间的异同点。分子生物学第六章基因重组思考题解释:recombination;single-st54四、免疫分子的多样性分子生物学第六章基因重组四、免疫分子的多样性分子生物学第六章基因重组55◘体液免疫反应免疫球蛋白（Immunoglobulin）：高度特异性、庞大多样性分子生物学第六章基因重组◘体液免疫反应分子生物学第六章基因重组56L链（214aa）－－VL、CLκ和λ两种，对一个Ig唯一H链（426aa）－－VH、CH1、CH2、CH3恒定区的序列有γ、α、μ、δ和ε五种类型VL和VH内有高变区－－真正抗原结合部位负责抗体分子对抗原的识别互补决定区－－CDRIgG、IgA、IgM、IgD和IgE（人体）分子生物学第六章基因重组L链（214aa）－－VL、CLVL和VH内有高变区－－Ig57

免疫球蛋白基因的组织◘Ig基因有三个独立的基因家族分别编码两个轻链（κ和λ）、一个重链（小鼠6、16和12号染色体）◘轻链基因家族的组成：L、V、J、C四类基因片段L－－leadersegmentV－－variablesegmentJ－－jioningsegmentC－－constantsegment◘重链家族：L、V、D、J、C五类片段D－－diversitysegment高变区◘J和C之间有增强子◘种系中基因数目变动较大分子生物学第六章基因重组免疫球蛋白基因的组织◘Ig基因有三个独立的基因家族分58FamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda<3002>64Kappa<300~100011Heavy~300>100098人的重链基因簇包括了所有组织重链的基因信息（重链恒定区九种C片段、两个假基因）分子生物学第六章基因重组FamilyVGenesCGenesManMouseMa59λ家族V基因后跟随着几个以J片段作为前导的C基因分子生物学第六章基因重组λ家族V基因后跟随着几个以J片段作为前导的C基因分子生物学第60k家族（人和老鼠）的组成：V基因（人<300、鼠～1000）、5个J（一个假基因）、1个C基因分子生物学第六章基因重组k家族（人和老鼠）的组成：V基因（人<300、鼠～10061免疫球蛋白基因形成过程中的重组机制◘除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因簇的结构都是相同的－－种系结构◘骨髓干细胞在分化为成熟B淋巴细胞时出现免疫球蛋白基因的体细胞重排◘即－－淋巴细胞中重组产生活性基因使免疫系统为基因组的改变提供了广泛的基础

－－抗体分子的多样性分子生物学第六章基因重组免疫球蛋白基因形成过程中的重组机制◘除淋巴细胞外，所有621、轻链基因V和J片段的重组a）λ链的重组◘每个C片段前有J跟随◘只发生一次重组在V和J-C之间(V和J的重组)分子生物学第六章基因重组1、轻链基因V和J片段的重组a）λ链的重组◘每个C63b）κ链的重组◘κ基因簇只有一个C◘V与C之间5个J（一个假基因）◘用到的每个J都可以成为V的外元终端整合J右边的J片段作为含子被剪切整合J左边的每个J片段都会缺失掉分子生物学第六章基因重组b）κ链的重组◘κ基因簇只有一个C◘V与C之64◘重链的可变区由V和J基因及第三个D基因片段编码◘重链的可变区重组有两个阶段D-J重组、VH和DJ重组2、重链基因V、D和J片段的重组分子生物学第六章基因重组◘重链的可变◘重链的可变2、重链基因V、D和J片65◘一个指定的B淋巴细胞产生λ、κ其中之一轻链同重链结合◘轻链中表现为同型性项斥（isotypicexclusion）往往只有κ链基因重组失败，才发动λ链基因重组◘抗体中大部分轻链是κ链，λ链往往占少部分人类有约60%的轻链是κ链，约40%为λ链。老鼠有95%的B细胞表达κ类型的轻链◘单特异性－－单个B细胞只产生一种抗体基因◘淋巴细胞为二倍体－－H、κ和λ都有两个等位基因－－－重组表现为等位基因排斥（allelicexclusion）分子生物学第六章基因重组◘一个指定的B淋巴细胞产生λ、κ其中之一轻链同重链结合663、重组的分子机制◘利根川进（TonegawaS）1987Nobelprize1）重组位点◘轻重链重组涉及相同的机理（特异位点）◘V下游、J上游、D两侧存在保守的重组信号序列（RSS）◘RSS:共同的回文七核苷酸－－CACAGTG（与基因连接）固定长度的间隔序列－－12bp或23bp共同的富含A的九核苷酸－－ACAAAAACC分子生物学第六章基因重组3、重组的分子机制◘利根川进（TonegawaS）