《细胞培养技术》课件

药物科学和技术学院细胞生物学周立军细胞培养技术1精选课件ppt药物科学和技术学院细胞培养技术1精选课件ppt上次课内容

细胞培养的基本知识一、绪论

培养法的种类、培养法的发展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用二、培养细胞的特征培养细胞的生长方式和类型、培养细胞的生长特点和生长增殖过程、细胞培养的条件及影响因素2精选课件ppt上次课内容

细胞培养的基本知识一、绪论2精选课件ppt一、光学显微镜二、电子显微镜三、显微操作技术显微镜及显微技术3精选课件ppt一、光学显微镜显微镜及显微技术3精选课件ppt—、光学显微镜4精选课件ppt—、光学显微镜4精选课件ppt1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。（一）普通光学显微镜5精选课件ppt1.构成：（一）普通光学显微镜5精选课件ppt6精选课件ppt6精选课件ppt显微镜的几个光学特点：介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好；sinα/2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5；普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。7精选课件ppt显微镜的几个光学特点：7精选课件ppt（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。8精选课件ppt（二）荧光显微镜FluorescencemicroscoFluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。9精选课件pptFluorescenceimage,DNAinbl（三）激光共聚焦扫描显微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；能显示细胞样品的立体结构；分辨力是普通光学显微镜的3倍；用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。10精选课件ppt（三）激光共聚焦扫描显微境

Laserconfocallaserconfocalscanningmicroscope,LCSM11精选课件pptlaserconfocalscanningmicrosLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/12精选课件pptLCSMImageofaXenopusMelano（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。13精选课件ppt（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscop把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。（五）相差显微镜14精选课件ppt把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的用途：观察未经染色的玻片标本。15精选课件ppt用途：观察未经染色的玻片标本。15精选课件ppt（六）偏光显微镜polarizingmicroscope用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台可以旋转。淀粉16精选课件ppt（六）偏光显微镜polarizingmicroscope用（七）微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。17精选课件ppt（七）微分干涉差显微镜Differentialinter（八）倒置显微镜inversemicroscope

物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。

18精选课件ppt（八）倒置显微镜inversemicroscope物镜（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体；自动化与电子化。19精选课件ppt（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧二、电子显微镜（一）透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM20精选课件ppt二、电子显微镜（一）透射电子显微镜20精选课件ppt以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比；由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成；分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍；用于观察超微结构（小于0.2µm）。1.原理21精选课件ppt以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50表二、不同光线的波长22精选课件ppt表二、不同光线的波长22精选课件ppt透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM23精选课件ppt透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRON23人类红细胞24精选课件ppt人类红细胞24精选课件ppt酵母25精选课件ppt酵母25精选课件ppt人类精子26精选课件ppt人类精子26精选课件ppt（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.01nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。27精选课件ppt（三）扫描隧道显微镜

scanningtunnelingSTMimageofaDNAmolecule28精选课件pptSTMimageofaDNAmolecule28精三、显微操作技术

micromanipulationtechnique是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，1952年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。29精选课件ppt三、显微操作技术

micromanipulationtec显微操作仪30精选课件ppt显微操作仪30精选课件ppt转基因显微操作过程

31精选课件ppt转基因显微操作过程31精选课件ppt小结一、细胞培养的必备设施无菌实验室、超净工作台、恒温培养箱、其他设备二、细胞培养常用器材及处理方法玻璃器材、塑料器材、橡皮器材、金属器材、其他用品三、显微技术及设备32精选课件ppt小结一、细胞培养的必备设施32精选课件ppt细胞培养用液和培养基33精选课件ppt细胞培养用液和培养基33精选课件ppt水：平衡盐溶液（BBS）：消化液：维生素液：染色液：一、细胞培养用液34精选课件ppt水：一、细胞培养用液34精选课件ppt（一）水35精选课件ppt（一）水35精选课件ppt（二）平衡盐溶液维持渗透压、调节PH值细胞生存能量、无机离子36精选课件ppt（二）平衡盐溶液维持渗透压、调节PH值36精选课件ppt（三）消化液原代培养分散组织细胞胰蛋白酶液：使细胞间蛋白质水解，细胞分散EDTA（二乙烯四乙酸二钠）：吸取Ca2＋，Mg2＋，使细胞分离胶原酶原代培养分散组织细胞联用37精选课件ppt（三）消化液原代培养分散组织细胞联用37精选课件ppt细胞培养用容器及培养基Culturevesselsandmediumforanimalcellculture二、培养基（液）38精选课件ppt细胞培养用容器及培养基二、培养基（液）38精选课件ppt培养基（液）是维持体外细胞生存和生长的溶液天然培养基：合成培养基：氨基酸、维生素、糖类无机离子、其它成分无血清培养基：

39精选课件ppt培养基（液）是维持体外细胞生存和生长的溶液39精选课件ppt（一）天然培养基天然培养基有生物性液体（血清），组织浸液（胚胎浸液），凝固剂（血浆）优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染40精选课件ppt（一）天然培养基40精选课件ppt血清(serum)：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。外观：透明淡黄色，无溶血，无沉淀。灭活：56度，30min消除补体活性。成分：总蛋白3.5-4.5g/100ml球蛋白不高于2g/100ml41精选课件ppt血清(serum)：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清42精选课件ppt42精选课件ppt①多种PR（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分43精选课件ppt①多种PR（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）43精选课件ppt关于血清的几个问题血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。44精选课件ppt关于血清的几个问题血清必须贮存于–20～-70℃，若

瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。45精选课件ppt瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20血浆：1907年Harrison首次使用优点：支持培养组织块，供给细胞生长物质。缺点：易于液化。46精选课件ppt血浆：1907年Harrison首次使用46精选课件ppt（二）合成培养基合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低

缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

47精选课件ppt（二）合成培养基合成培养基：根据细胞生存所需物199液：成分多达69种，单独使用只能维持细胞生长数天，应用不多。在生理盐水的基础上加入氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、胆固醇、ATP等。Eagle培养液：MEM（Eagle’sminimumessentialmedium）BME（BasalEagleMedium）DMEM（DulbeccoMEM）RPMI1640培养液：应用最广泛。组成简单，适宜多种细胞生长。Ham培养液：加入了一些微量元素、无机离子，在低血清浓度下使用，适于单细胞培养和克隆化培养。高糖型—生长快、附着性差的肿瘤细胞低糖型48精选课件ppt199液：成分多达69种，单独使用只能维持细胞生长数天，应用干粉培养基商品培养液49精选课件ppt干粉培养基商品培养液49精选课件ppt抗生素:

在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。

青霉素（50~100IU/ml培养液）链霉素（50~100ug/ml培养液）50精选课件ppt抗生素:50精选课件ppt完全培养基的组成:基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青霉素50~100IU/ml培养液链霉素50~100ug/ml培养液51精选课件ppt完全培养基的组成:51精选课件ppt配制:RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100IU/ml加三蒸水至1000ml,过滤除菌,调节pH值至7.2,加血清（终浓度10％）.52精选课件ppt配制:52精选课件ppt（三）无血清培养基53精选课件ppt（三）无血清培养基53精选课件ppt

血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，故在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．54精选课件ppt54精选课件ppt1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。55精选课件ppt55精选课件ppt

向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。商品化的无血清培养液供应。如：

Sigma公司的MCDB131可用于培养内皮细胞Biofluids公司的LHC-9用于气管上皮细胞提高制品安全性和/或产量.56精选课件ppt向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适

无血清培养基替代血清的补充成分

优点：增加确定性；

�性能更一致；容易进行纯化和下游加工；

缺点：无血清培养基尚处于研究阶段难以推广。

基础培养基57精选课件ppt基础培养基57精选课件ppt附加成分培养基质营养成分酶抑制剂58精选课件ppt附加成分培养基质58精选课件ppt培养基质的配制纤维粘连素用1mol/L的尿素PBS，配成1mg/ml的母液。多聚赖氨酸用PBS配成1mg/ml的母液。胶原用0.1mol/L盐酸或0.1mol/L醋酸配成1-3mg/ml母液。均于-20度保存。59精选课件ppt培养基质的配制纤维粘连素59精选课件ppt培养基质的使用步骤可直接加入培养基中，或先涂布于培养瓶表面。涂布于培养瓶表面步骤：1.稀释母液：用高纯度的蒸馏水稀释成0.1mg/ml;2.过滤除菌0.22微米微孔过滤；3.均匀涂于培养瓶表面，室温，静置5min.60精选课件ppt培养基质的使用步骤可直接加入培养基中，或先涂布于培养瓶表面。营养成分目的：补加各种不同细胞生长所需以及血清中已知促细胞生长物质。如：胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、维生素A、生长因子、生长激素、胰高血糖素、牛血清白蛋白等。61精选课件ppt营养成分目的：补加各种不同细胞生长所需以及血清中已知促细胞生酶抑制剂目的：替代血清的保护作用。用于无血清培养基。常用：0.1%-0.5%的大豆胰酶抑制剂，用基础培养基配制，过滤后-20度保存。使用：在酶消化后；或直接加入培养基。62精选课件ppt酶抑制剂目的：替代血清的保护作用。用于无血清培养基。62精选细胞周期及其调控63精选课件ppt细胞周期及其调控63精选课件ppt细胞周期基本概念细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesisphase)，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosisordivision)，细胞分裂开始到结束。64精选课件ppt细胞周期基本概念细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂65精选课件ppt65精选课件ppt高等动物细胞的分类从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。66精选课件ppt高等动物细胞的分类从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三细胞周期差异的主要原因细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关。如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。67精选课件ppt细胞周期差异的主要原因细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关细胞周期测定测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。68精选课件ppt细胞周期测定测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数细胞同步化细胞同步化(synchronization)：是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化。自然同步化人工同步化69精选课件ppt细胞同步化细胞同步化(synchronization)：是指（一）自然同步化1．多核体如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。疟原虫也具有类似的情况。2．某些水生动物的受精卵如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。3．增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。

不存在于动物及人体70精选课件ppt（一）自然同步化1．多核体70精选课件ppt（二）人工同步化选择同步化诱导同步化有丝分裂选择法细胞沉降分离法DNA合成阻断法中期阻断法71精选课件ppt（二）人工同步化选择同步化诱导同步化有丝分裂选择法细胞1．选择同步化1）有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，MI高。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～2%）2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。72精选课件ppt1．选择同步化1）有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增2、诱导同步化1）DNA合成阴断法：

DNA合成的抑制剂：可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，将细胞群阻断在S期或G/S交界处。如：5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR。高浓度TDR——细胞毒性较小，常用TDR双阻断法诱导细胞同步化。如：对数生长期的细胞，

＊加入过量TDR，（Hela，2mol/L；CHO，7.5mol/L）。

＊移去TDR洗涤加入新鲜培养液细胞开始分裂当释放时间大于TS时，所有细胞均脱离S期

＊再次加入过量TDR，细胞继续运转至G1/S交界处。