《天然产物分离技术》课件

天然产物分离技术四川大学华西药学院1精选ppt天然产物分离技术四川大学华西药学院1精选ppt前言重要性

天然药物的开发（WTO，知识产权）提取基础分离2精选ppt前言重要性2精选ppt提取

1文献化学成分种类2系统预试3提取溶剂

a水（鞣质、糖类、蛋白质）

HClNaOH成盐溶出冷水、热水

b醇（乙醇、甲醇）

95%--alkaloids60-70%--皂苷、黄酮苷40-50%--强心苷

c丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）3精选ppt提取3精选ppt

4提取方法

a冷浸法（3-4次）

优缺点

b渗漉法（10倍量）

受热易分解物溶剂梯度

c煎煮法（3-4次）水或稀醇4精选ppt4提取方法4精选ppt分离

1分类a粗分（部位分离）b细分（部位分组分离）c单离（单体成分分离）

2方法层析（平面层析、柱层析、逆流层析）SFE结晶5精选ppt分离5精选ppt平面层析TLC定性：预试对照——标准品种类：硅胶G,GF254显色：广泛——碘、H2SO4—EtOH专属——alkaloids,flavonoids等6精选ppt平面层析TLC6精选pptPTLC（PreparativeTLC）

制备量g级

1吸附剂（adsorbents）材料：Silicagel尺寸：20*2020*40厚度：0.5-2mm2样品带手工自动点样器7精选pptPTLC（PreparativeTLC）7精选ppt样品带宽的解决方法a用极性流动相展开约2cm，使带变窄b用带浓缩带的板子

3流动相选择

三角性法则4样品的收集洗脱

显色：定位转移洗脱8精选ppt样品带宽的解决方法8精选ppt

5

PTLC制备样品时引入的杂质

粘合剂杂质指示剂Other(分解物)(Al2O3作吸附剂)

难点解决办法：SephedexLH-20

9精选ppt5PTLC制备样品时引入的杂质9精选ppt6技术发展

aHPTLCb巨形板TLC

不锈钢板(60*60)厚度5mm上样量＞10gc带浓缩带TLCd展开方式

多次展开（同方向）双向展开

e移植TLC10精选ppt6技术发展10精选pptOPLC（OverpressureLayerChromatography）又称OverpressureTLC(OPTLC)

1简介

1979年Tyihak综合TLC,HPTLC优点，吸收HPLC的某些特点。

平面细颗粒蒸汽相恒流速11精选pptOPLC（OverpressureLayer11精选pp

2装置

3特点

a与传统PTLC比较b效率50mg~0.5g1hc优点4制备型OPLC

联机检测分段收集

5应用氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等12精选ppt2装置12精选ppt离心薄层层析（CTLC）centrifugalTLC,Chromatotron1概述CTLC是在TLC和柱色谱基础上发展起来利用旋转离心力，连续洗脱2仪器倾斜盘流动相中央进入梯度、UV检测、N2保护固定相活化反复使用13精选ppt离心薄层层析（CTLC）13精选ppt3特点

优点：

（1）快速<30min（2）流动相少（3）可反复使用（4）进样方便（5）直接洗脱（6）直接检测，接收灵活（7）可梯度洗脱（8）占地小，移动方便（9）分离杂质少14精选ppt3特点14精选ppt3特点

缺点：

（1）固定相限制（2）Rf值（3）显色（4）收集污染（5）上样量少4应用

生物碱、人参皂苷5注意事项15精选ppt3特点15精选ppt柱层析

ColumnChromatogrphy

常压柱层析(0.1~50g)

（OrdinaryColumnChromatogr.）

吸附性柱色谱

分配性柱色谱植物有效

柱色谱离子交换柱色谱成分分离

凝胶过滤柱色谱主要手段聚酰胺柱色谱大孔吸附树脂16精选ppt柱层析

ColumnChromatogrphy常一、吸附性柱层析Al2O3orSilicagel

生物碱水溶性

Al2O3甾体脂溶性Silicagel挥发油脂溶性

1装柱Al2O3：吸附剂:样品(20~50:1)(20~100:1)Silica：吸附剂:样品(30~100:1)(300~400:1)1)干法与TLC吻合度较好，溶剂消耗少2)湿法紧密，前沿整齐

17精选ppt一、吸附性柱层析17精选ppt2上样1)湿法溶剂溶解上样（少量），低极性2)干法低极性溶剂溶解性差3洗脱常压低压梯度洗脱4收集与检查

等份TLCUV18精选ppt2上样18精选ppt二、聚酰胺（Polyamide）

1原理a氢键吸附原理酰胺键

酚类、酸类、醌类、硝基化合物成氢键能力与溶剂有关水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH氢键吸附规律：基团多少；基团位置；芳香核，共轭双键；分子内氢键

b极性吸附原理非极性脂肪链

萜类、甾体、生物碱

黄酮苷与苷元非水（正相）含水（反相）19精选ppt二、聚酰胺（Polyamide）19精选ppt

2聚酰胺粉的制备国产（15~30目）层析用（80~100目）

粗粉蒸馏水浸泡过夜，磨细，混悬液直接使用抽滤后，60~80度烘干2~3小时备用3操作a装柱细粉水浸泡装柱，自然沉降b上样20~30%水溶液上样40-60:1c洗脱水含水醇95%醇3%NaOH5%NaOH4再生5%NaOH20精选ppt2聚酰胺粉的制备20精选ppt三、分配性柱层析

1原理利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分离效果愈好。2支持剂

硅胶、硅藻土、纤维粉

3溶剂系统的选择PC层析选择4操作a装柱b上样c洗脱21精选ppt三、分配性柱层析21精选ppt四、凝胶柱层析（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝胶简介

由葡聚糖凝胶SephadexG-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附层析、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。德国科学家HansHenke著有SephadexLH-20凝胶色谱分离专著，详尽叙述了SephadexLH-20在植物化学研究中的应用。22精选ppt四、凝胶柱层析（SephadexLH-20）22精选ppt

2原理

分子筛：分子的大小和形状吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键分配层析：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配

3操作a装柱洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱b上样c洗脱

水溶性好水或电解质溶液水溶性差醇水或丙酮水极性较小丙酮、氯仿23精选ppt2原理23精选pptd浓缩

视情况而定

e再生洗脱剂平衡有污染：0.2NNaOH---0.5NHCl浸泡水洗净---平衡保存：50%丙酮水溶液4应用实例例如，SephadexLH-20层析分离川穹里的腺嘌呤，贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶，日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多种中草药中的芦丁芸香苷，红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。24精选pptd浓缩24精选ppt五、离子交换柱层析

1原理利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而进行的交换性柱层析方法。

2影响离子交换的因素

PH值欲交换化合物的性质欲交换化合物的浓度温度交换溶剂交换流速树脂用量25精选ppt五、离子交换柱层析25精选ppt3树脂的选择李伯廷书91页

4操作a树脂预处理b装柱c上样d交换e洗脱f树脂再生5实际应用26精选ppt3树脂的选择26精选ppt六、大孔吸附树脂层析

1大孔吸附树脂简介

大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构。药液通过大孔树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的有效方法。非极性吸附树脂在吸附药液中成分时,主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用，不同的树脂有不同的针对性。其操作的基本程序大多是：提取液－通过大孔树脂－吸附上有效成分的树脂－洗脱－洗脱液回收－洗脱液干燥－半成品。该技术目前已较广应用于新药的开发和生产中,主要用在分离和提纯过程中。2大孔吸附树脂的优点

经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。大孔树脂吸附技术还能缩短生产周期,所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。27精选ppt六、大孔吸附树脂层析27精选ppt3大孔吸附树脂吸附机理

4影响分离的因素

分子极性大小分子体积PH值树脂柱的清洗洗脱液的选择28精选ppt3大孔吸附树脂吸附机理28精选ppt5操作a树脂预处理b装柱c上样d洗脱e树脂再生

6实际应用

适合中等程度的水溶性化合物中药、天然色素，从发酵液中得到抗生素、（青霉素先锋霉素螺旋霉素）蛋白质（胰岛素肽系抗生素）功能性食品添加剂（维生素）等聚苯乙烯合成吸附树脂吸附含有π电子的化合物如含有苯环和共轭双键的化合物

甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等与H可结合的官能团的化合物

29精选ppt5操作29精选ppt

特殊柱层析

（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱层析

减压柱层析植物有效成分

特殊柱层析短柱柱色析分离新方法闪式柱色析棒色谱

一、干柱柱层析

1简介30精选ppt特殊柱层析30精选ppt

2特点

a优点

分离效果比湿法装柱高可用薄层最佳分离条件直接套用对有荧光或颜色的物质，可在紫外灯下将已分离的各层带分别切开，避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带交叉适用于制备性分离设备简单，消耗溶剂少，工时省，共轭双键；分子内氢键

b缺点

样品容量比湿法装柱小，因此，消耗填充剂量大

31精选ppt2特点31精选ppt

3原理与薄层层析相同，借颗粒间的孔隙所产生的毛细作用而展层，因此，可套用薄层条件，分离效果亦相同。干填充剂颗粒的深孔内充满空气，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，吸附与解吸主要在外部表面进行。克服了样品分子由于进出填充剂深孔所造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。

a种类（填充剂）氧化铝活性III~V吸附层析硅胶活性II~III干柱聚酰胺层析分配层析32精选ppt3原理32精选pptb展开剂

多采用混合溶剂

避免溶剂解混产生，影响分离效果解决办法：搭配极性相差适当的溶剂

如石油醚－乙醚氯仿－乙醇石油醚－乙醇氯仿－甲醇

苯、苯酚等不透过紫外光的溶剂对紫外光灯检出层带有影响

c分离条件探索

探索和选择对样品分离度最大的填充剂和展开剂

薄层层析(最佳分离条件)

同批次33精选pptb展开剂33精选pptd样品容量

1:100~1:300

样品只能与吸附剂的外部表面接触

4操作a柱的制备(常用50cm)

聚乙烯薄膜柱玻璃柱

b加样和展开加样：溶液加样；拌样加样展开：

c层带的定位及分割

34精选pptd样品容量34精选ppt二、减压柱层析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

1简介

简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分）2操作

G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽滤瓶、减压泵及分部收集瓶组成。a装柱b上样c洗脱d收集35精选ppt二、减压柱层析35精选ppt

3注意事项a真空度

20~70mmHg

b洗脱剂极性由小到大梯度递增

c交叉色带4应用实例二萜生物碱的分离黄酮类化合物的分离

36精选ppt3注意事项36精选ppt三、短柱柱层析（抽柱VacuumLiquidChromatography)

短柱柱层析在制备量分离方面有独到之处，在微量成分的富集上有一定实用价值。1短柱层析理论

经典色谱理论：柱效随柱径的加大而下降，柱子愈长，分离越好，柱效越高。

近来研究发现，此理论有一定局限性，在实践基础上，提出新的观点：柱径加大后，在适当条件下柱效反而提高。a适当条件：柱径：3~20cm短粗柱柱长：5~30cm37精选ppt三、短柱柱层析37精选pptb原因

(1)Knox提出“无限直径效应”，认为柱短，柱径相对较粗，层析相对集中于中部进行，消除或减少了“柱壁效应”。(2)柱短，可使洗脱液在柱内受阻减少，且截面增大，使自然流速大大增加，为采用高细度吸附剂提供了可能条件。

2层析方法同普通柱层析，不同之处在于采用短粗柱，使用吸附剂粒度细小，且粒度范围窄，装柱应尽量均匀。洗脱时多采用梯度洗脱，对洗脱剂选择较严格。

3注意事项a填料、洗脱剂bRf>0.2c预纯化操作38精选pptb原因38精选ppt四、闪式柱层析（FlashChromatography)

20世纪700年代后发展起来的一种快速柱层析技术。1简介

柱短，分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（FlashSicicagel）

进口，国产（山东即墨化学试剂厂）球型微粒，粒度在40-63um(230-400目)之间（均匀）

加压层析0.3-1Kg/cm210mg-10g样品10-15min

39精选ppt四、闪式柱层析39精选ppt

2

操作

与普通柱层析法基本相同。a装柱：湿法干法（20cm）b上样：拌样湿法c洗脱：Rf0.2-0.3加液8-10cm，加压3实际应用

皂苷、甾体、生物碱、黄酮

40精选ppt40精选ppt五、棒色谱（StickChromatography)

1简介

与制备型薄层层析原理相同,分离量大。把硅胶、氧化铝等制成园柱形的棒，下端上样，上行展开而达到分离目的。（吴凤鄂）2操作

a制棒b上样c展开引导座－－两端相通，内填层析硅胶展开装置－－层析槽，密封罩d收集3应用

生物碱、皂苷、甾醇等41精选ppt五、棒色谱（StickChromatography)41

加压柱层析

（PressureLiquidChromatogr.）类型

低压柱层析

加压柱层析中压柱色析高压柱色析

优点

分离因子a高，故能完成复杂的分离过程

a=两组分的相对保留时间之比分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标42精选ppt加压柱层析42精选ppt

制备型与分析型的区别：分析型：不要求样品回收制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的层析装置和操作系统基本原理1加压柱层析效果的好坏

Speed分析型制备型ResolutionLoad与Load相关的因素柱径柱长粒度填充剂密度43精选ppt制备型与分析型的区别：43精选ppt

2加压柱层析目的

得出一个化合物Lab.一定纯度生产规模回收率单位时间内分得的化合物量

洗脱液流速快可用更细的颗粒，分辨率提高避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解（最大优点）44精选ppt44精选ppt

3分类（Classifcaton）

AnalyticalHPLC:ug---<5mgPrep.HPLC:5mg---gmsLow-pressureLC:10mg---1gMedium-pressureLC:100mg---100g

选择制备型系统要考虑的事

以上各法的极限（适应范围）要分离的样品量根据以上条件要求而选用的方法柱大小，固定相，压力，洗脱剂

经验积累45精选ppt45精选ppt

4操作aTLC探索条件（层析系统选择）b分析型小试c优化条件（超载）d套用优化条件（制备）e正式操作f获得纯品g分析鉴定纯品h再生柱正相：actone—water—methanol—THF---dichloromethane反相：water---methanol46精选ppt46精选ppt

5Prep.LC的各种条件的应用情况及优化aColumn:loading,f,size,columnefficiency,a,K’numberoftheoreticalplates,resolutionbStationaryphase:液—液,固—液,粒度大小硅胶---普通,键合相AgNO3—c