线虫的分类鉴定

关于线虫的分类鉴定12一、植物线虫分类的基本概念和内容植物线虫分类的目的和内容主要包括以下几个方面:

(1)鉴定：研究区分和确定植物线虫的各个种类，按照国际动物命名法规予以命名，并加以描述，提供正确识别和辨别线虫种类的知识和资料。

(2)分类：根据线虫种类之间的异同及亲缘关系，确定其所属的分类阶元层次，制定分类系统。

(3)系统学：探寻线虫种类的起缘及其之间的亲缘关系，追溯其进化过程。

(4)分类学：狭义的植物线虫分类学是研究植物线虫分类的方法和理论，广义的植物线虫分类学就是研究上述诸内容的一门科学。第2页,共38页，2024年2月25日，星期天3

植物线虫分类的基本概念和内容

植物线虫分类学：是运用比较、分析和归纳等方法，依据线虫表达系统发育关系的性状或性状组合，对植物线虫进行鉴定、命名和排序，制定可以反映植物线虫进化过程或阐明各类群内在关系的分类系统，进而揭示植物线虫的起源及各种群之间的亲缘关系，同时不断探索新的分类方法和理论。

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植物线虫分类鉴定的依据形态学生物化学细胞遗传学鉴别寄主分子生物学第4页,共38页，2024年2月25日，星期天5二、植物线虫的形态分类特征形态特征是最直观、最常用的分类特征。但仅仅依靠形态特征难以区别一些种类，特别是一些近缘种。所以有必要使用形态以外的其他性状特征，如遗传学性状、生理生化性状、分子性状以及生态、行为、地理等性状都已开始应用于植物线虫的分类鉴定。形态性状往往明显地反映生物进化、反映物类(或物种)的亲缘关系及生活关系，所以目前植物线虫分类，主要还是以形态性状为基础的形态分类。第5页,共38页，2024年2月25日，星期天6

植物线虫的形态分类特征目前，植物线虫形态分类所依据的特征，主要是外部和内部形态特征。外部形态特征主要包括体形、角质层结构、头部和尾部特征，内部形态特征主要包括消化系统和生殖系统结构特征等。植物线虫各发育时期的形态以及雌、雄虫的形态均有差异，分类定种，多数是依据成熟雌虫的形态，异形虫的年青雌虫形态也是重要定种依据。幼虫和雄虫形态一般不作为定种的主要依据，只作为参考和辅助依据。第6页,共38页，2024年2月25日，星期天7

植物线虫的形态分类特征在植物线虫的分类鉴定中，数量特征和质量特征均用于种的鉴定上；属及其以上高级阶元的鉴定一般主要依据质量特征。第7页,共38页，2024年2月25日，星期天8

植物线虫的形态分类特征（一）形态特征测计(数量特征)关于数量特征的测量计算，DeMan(1880)提出一套公式，后来该公式又得到补充和完善。第8页,共38页，2024年2月25日，星期天9

植物线虫的形态分类特征（二）形态特征描述(质量特征)

1.外部形态结构

(1)体形和死态

(2)角质层

①环纹：细、粗、中等，表面光滑或有外生附着物；②侧区：纵线或刻线数，是否有网纹，网纹所在部位、宽度及其占虫体宽的比例；③纵脊或纵线：侧区以外是否有纵脊或纵线。

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植物线虫的形态分类特征(3)头部①总的形态：球形、半圆形、圆锥形等，前缘平、平圆、圆等，高、低环纹数等；②与体部有无明显界限：无缢缩(连续)、微缢缩、缢缩；③唇区结构及形态：唇区位于头部前端，其模式结构是两个侧唇瓣、两个亚背唇瓣和两个亚腹唇瓣；呈辐射状排列，唇区的形态特征是重要的依据；④头架：角质化或骨化或硬化的程度(强、弱或显著、不显著)；⑤侧器：口腔两侧各有一个侧器，侧器口的形状也是重要的分类依据。第10页,共38页，2024年2月25日，星期天11

植物线虫的形态分类特征

(4)乳突(papilla)：头乳突、颈乳突、交配乳突、泄殖腔唇乳突和尾乳突等是常用的鉴定特征。

(5)尾部(tail)①尾部长度：长、短；②尾形：细或宽圆筒形、细或宽圆锥形(对称或不对称)、丝状、棒状、杆状等；③尾末端形态：锐尖、尖、细尖、钝尖、平、平圆、半圆，光滑、有环纹等；④尾端上有无附着结构：尾突(尾末端上突起)、尾尖突(尾突上的突起或很细的尾突)及其形态和个数等；⑤尾腹环数：尾部较短并且环纹清楚的类群常要数尾腹部环纹数。第11页,共38页，2024年2月25日，星期天12

植物线虫的形态分类特征2.内部结构(1)消化系统(digestivesystem)①口针：粗、细，有无基部球及基部球形态(球形、凸缘状、郁金香形、锚状等)。②食道：食道类型及结构在高级阶元的分类上非常重要。③食道腺开口：滑刃目线虫背食道腺开口位于中食道球，垫刃目线虫背食道腺开口位于口针基部球后的食道前体部，这两类线虫的2个亚腹食道腺开口位于中食道球，垫刃目线虫的背食道腺开口与口针基部球的距离是一些种、属的重要鉴定特征。④肠：在分类鉴定中意义不大。⑤肛门：常描述的是该处体宽，有的肛门略凸起，也只作为描述特征，不作为鉴定检索特征。第12页,共38页，2024年2月25日，星期天13

植物线虫的形态分类特征(2)生殖系统：线虫的生殖系统很发达，是分类上重要性状。雌虫生殖系统的描述：

①生殖腺单个(前伸或后伸)、1对(对伸或前伸)；②单个生殖腺的是否有后阴子宫囊，后阴子宫囊长度；③生殖腺的长、短；④卵巢直伸或转折(1、2或多个转折)；⑤卵母细胞单行、双行或多行排列；⑥受精囊有或无；⑦子宫：是否有卵、卵的多少、长度(较少描述)；⑧阴道：长度(占阴门处体宽的比)，垂直体中轴或斜向前(后)伸；⑨阴门：位置，阴门形态：横裂、纵裂、孔状。第13页,共38页，2024年2月25日，星期天14

植物线虫的形态分类特征雄虫生殖系统的描述：

①生殖腺单或双，长度，若单生殖腺则其前伸或后伸(一般前伸)，是否转折；②贮精囊是否明显；③交合刺形态：瑰玫刺状、新月状、镰刀状等；④引带有无；⑤交合伞有无及其长度，与尾的位置关系。贮精囊第14页,共38页，2024年2月25日，星期天15

植物线虫的形态分类特征(3)排泄系统：排泄孔的位置，有时要描述排泄管角质化程度。(4)神经系统：侧尾腺是线虫高级阶元的重要分类特征，在纽带科中，侧尾腺口的形态和位置也是种、属的重要鉴定特征；雄虫泄殖腔前后的乳突统称生殖乳突，也是重要的分类鉴定特征；神经环和半月体通常作为描述特征，有时也作为种的鉴定特征。第15页,共38页，2024年2月25日，星期天16

植物线虫的其他鉴定方法1.生物化学鉴定法（雌虫的同功酶图谱）第16页,共38页，2024年2月25日，星期天17

植物线虫的其他鉴定方法2.鉴别寄主方法：鉴别寄主反应：烟草、棉花、辣椒、西瓜、花生、番茄等。鉴别寄主

Differentialhost烟草

Tobacco棉花

Cotton辣椒

Pepper西瓜

Watermelon花生

Peanut番茄

Tomato结果Results+--+-+鉴别寄主反应注：“+”表示该植物能被侵染；“-”表示该植物不能被侵染第17页,共38页，2024年2月25日，星期天18

植物线虫的其他鉴定方法3.分子生物学方法（1）PCR

（2）rDNA-ITS

（3）PCR-RFLP

（4）RAPD

（5）SSR-PCR

（6）分子杂交第18页,共38页，2024年2月25日，星期天19近年来，越来越多的分子生物学技术应用到植物病原线虫学研究领域,在植物线虫病害诊断、分类以及流行学调查方面得到广泛应用，下面详细介绍PCR、PCR-RFLP、RAPD、分子杂交等目前常用的分子技术。第19页,共38页，2024年2月25日，星期天20（1）多聚酶链式反应（PCR）PCR技术基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使之成为单链；模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第20页,共38页，2024年2月25日，星期天21引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。第21页,共38页，2024年2月25日，星期天22最后这种DNA片段能在普通琼脂糖凝胶上进行电泳。观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，它含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。溴化乙锭在标准302nm紫外光透射仪激发下放射出橙红色信号，可用凝胶成像处理系统拍摄。第22页,共38页，2024年2月25日，星期天23PCR电泳图第23页,共38页，2024年2月25日，星期天24应用实例：第24页,共38页，2024年2月25日，星期天25rDNA-ITS鉴定根结线虫（2）rDNA-ITS鉴定根结线虫第25页,共38页，2024年2月25日，星期天26rDNA-ITS测序后同源性聚类分析的系统进化树第26页,共38页，2024年2月25日，星期天27（3）PCR-RFLP方法聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法的原理是：采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特异切位点，由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。第27页,共38页，2024年2月25日，星期天28第28页,共38页，2024年2月25日，星期天29应用实例第29页,共38页，2024年2月25日，星期天30（4）RAPD技术随机扩增的多态性DNA，RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。第30页,共38页，2024年2月25日，星期天31

植物线虫的其他鉴定方法M.incognitaM.javanicaM.arenariaRAPD-PCR鉴定根结线虫第31页,共38页，2024年2月25日，星期天32应用实例第32页,共38页，2024年2月25日，星期天33（5）SSR-PCR技术由于真核生物中富含CA重复序列，SSR－PCR就是针对高度密集的CA微卫星体简单重复序列，设计与之互补的重复CA碱基作引物扩增其重复片段，从而揭示其多态性。第33页,共38页，2024年2月25日，星期天34（6）分子杂交技术核酸的分子杂交(molecularhybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。第34页,共38页，2024年2月25日，星期天3