猪脂肪神经嵴干细胞制备技术规程

1DBXX/XXXXX—XXXX猪脂肪神经嵴干细胞制备技术规程本标准规定了猪脂肪神经嵴干细胞制备的材料和环境要求、技术要求等。本标准适用于猪脂肪神经嵴干细胞的相关生产和试验性研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/TGB/TGBGB/T5458-201218883-200219489-20086682液氮生物容器室内空气质量标准实验室生物安全通用要求分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件：3.1神经嵴干细胞是一种具有多能性分化潜能的祖细胞，是脊椎动物胚胎发育期的一个过渡型结构，由一部分神经外胚层细胞在胚胎发育过程中游离出来而形成的与神经管平行的细胞索，具有极强的迁移能力和多潜能性。4制备环境4.1制备过程在无菌室和生物安全柜中进行。4.2制备用品均须进行高压蒸汽灭菌(1.05kpa120℃30分钟)。4.3制备环境应符合GB19489的规定。5设备及材料5.1设备材料5.1.1二氧化碳培养箱、生物安全柜、冰箱、低速离心机、无菌取样器、无菌镊子、无菌手术刀、无菌培养皿、无菌盖玻片、无菌取样瓶、一次性刮板5.1.2试剂要求胶原蛋白、DMEM细胞培养液、犊牛血清、磷酸缓冲盐溶液（优级纯）、75%酒精（分析纯）、丙酮酸钠（优级纯）、尿苷（优级纯）、盘尼西林（优级纯）、链霉素（优级纯）。细胞培养液配制过程用水需符合GB/T6682，具体配方见表12DBXX/XXXXX—XXXX表1细胞培养液配方组分含量%DMEM87.9犊牛血清丙酮酸钠（1mmol/L）1尿苷（0.05mg/ml）0.1盘尼西林（50U/ml）0.5链霉素（50U/ml）0.56制备流程6.1细胞分离将胶原蛋白均匀涂于培养皿底部，培养皿置于二氧化碳培养箱中37℃孵育1h。6.1.2组织取样无菌条件下采取猪颈部脂肪组织，75%酒精漂洗3遍，然后磷酸缓冲盐溶液漂洗3遍，最后置于高糖DMEM细胞培养液中。6.1.3组织培养培养皿中加入约0.2mL培养液，将猪脂肪组织取出放入培养皿中，盖上灭菌的盖玻片，使组织与平皿底部接触，二氧化碳培养箱（5%CO2）中37℃静置培养。培养1h后，加入适量培养液，按照1h的间隔，此过程重复2次，操作过程中保证组织块不游离出盖玻片。每3天更换新鲜培养液，约1～2周后，显微镜下观察脂肪组织周围游离出的细胞即为原代细胞。6.2原代培养6.2.1细胞收集取出组织所压盖玻片，吸弃细胞培养液，滴加磷酸缓冲盐溶液洗涤贴壁细胞2～3次。加胰酶室温消化（37℃消化3分钟左右）至80%以上贴壁细胞变圆。加入细胞培养液终止消化，将细胞转至新的培养皿。6.2.2细胞培养将培养皿置于二氧化碳培养箱（5%CO2）中37℃培养。6.3传代培养6.3.1传代准备当原代贴壁细胞密度达到70%～80%时，吸弃细胞培养液，磷酸缓冲盐溶液洗涤2～3次。加胰酶室温消化（37℃消化3分钟左右）至80%以上贴壁细胞变圆，加入细胞培养液终止消化。6.3.2细胞培养将下消化好的细胞以1:3比例转至其它培养皿中，二氧化碳培养箱（5%CO2）37℃继续培养。6.4细胞冻存6.4.1细胞富集3DBXX/XXXXX—XXXX将待保存细胞中的培养液移去，磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2～3次。加胰酶室温消化（37℃消化3分钟左右）至80%以上贴壁细胞变圆。加培养液终止消化，全部吸出置于离心管中，1000转/分钟离心10分钟，得到富集好的细胞。6.4.2冻存处理弃去离心管上清液，加入细胞冻存液，分装于冻存管中，编码，置于-20℃冰箱冷冻2h、-70℃超低温冰箱冷冻12h后转移至液氮中长期保存。6.5细胞复苏6.5.1复苏孵育从液氮罐中取出细胞冻存管，在37℃下孵育2分钟，以75%酒精擦拭冻存管外部，放置到生物安全柜中。6.5.2复苏培养将解冻的细胞悬液转移至无菌离心管中，缓慢加入室温（20℃~25℃)培养液，将全部液体转移至培养皿中，二氧化碳培养箱（5%CO2）中37℃培养。细胞贴壁率达到70%～80%时，即可进行细胞传代。6.6细胞鉴定6.6.1特异性蛋白分析用免疫荧光染色猪神经嵴干细胞，OCT4，Sox2，Sox10蛋白在荧光显微镜下观察表现为阳性荧光颜色。6.6.2多功能基因表达分析采用荧光定量PCR技术标记脂肪神经嵴干细胞的多功能基因OCT4、SOX2、NANOG、REX、cMyc，PCR产物表达即证明所获猪神经嵴干细