细胞凋亡与免疫

关于细胞凋亡与免疫2引言☆细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程，它与细胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相互制约的关系，才保证了生物体的正常发育。☆正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞凋亡，都会使机体出现病症。因此对细胞凋亡的研究有助于某些疾病的阐明与治疗。☆细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的热点课题。早期基于形态学和生物化学，近期则是基于分子生物学技术从基因调控、信号转导等方面研究。第2页,共102页，2024年2月25日，星期天3主要内容细胞凋亡概述（基本概念、意义、

生物学特征、调节、信号传递等）细胞凋亡与免疫生理细胞凋亡与免疫病理细胞凋亡的检测方法细胞凋亡研究相关展望第3页,共102页，2024年2月25日，星期天一细胞凋亡概述1.基本概念及生物学意义：

凋亡（apoptosis）一词于1972年Kerr（英国阿伯丁大学病理学教授）引入，是一个希腊语合成词,原意指花瓣或树叶的自然脱落（Apo脱落＋ptosis飘零=Apoptosis）。

基本概念：细胞凋亡是一个“形态学”概念，是对细胞超微结构观察的基础上得出的特指一种由基因控制、形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式。第4页,共102页，2024年2月25日，星期天1972年，Kerr,Wylle和Curry在许多正常组织中观察到一种与经典的细胞坏死形态特征不同的现象：细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细胞等，据此，他们首次提出apoptosis一词。国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、细胞衰亡等，多数学者倾向于“细胞凋亡”。强调这一过程是一种自然的生理学过程。第5页,共102页，2024年2月25日，星期天6

细胞凋亡与细胞程序性死亡细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。细胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地关系。大多数情况下程序性细胞死亡是以凋亡的方式进行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。第6页,共102页，2024年2月25日，星期天如烟草蛾节间肌肉细胞、哺乳动物某些神经元和红细胞，它们的程序性死亡是以非凋亡的方式进行。有时由外源性理化因子刺激诱发的细胞死亡，形态上似凋亡，但并不是由细胞内原装程序所引发，也不能称为程序性细胞死亡（如放疗后肿瘤组织坏死等）。

因此细胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。

细胞凋亡与细胞程序性死亡第7页,共102页，2024年2月25日，星期天8细胞凋亡的生物学意义：近年来对细胞凋亡的研究日渐重视，现代研究结果表明：细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础，而且在胚胎发育、造血、免疫、乃至肿瘤形成中都有极为重要的作用。

1.确保正常的生长发育(development)：清除无用、多余的细胞。2.维持内环境稳定(maintenanceofhomeostasis)：清除受损、突变或衰老的细胞。3.发挥积极的防御功能(defensereaction)：清除病毒感染细胞等对机体有害的细胞。第8页,共102页，2024年2月25日，星期天

Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis.

Tissueremodeling.第9页,共102页，2024年2月25日，星期天

Theresorptionofthetadpoletailatthetimeofitsmetamorphosisintoafrogoccursbyapoptosis.Eliminationoftransitoryorgansandtissues.

第10页,共102页，2024年2月25日，星期天第11页,共102页，2024年2月25日，星期天细胞凋亡参与皮肤更新第12页,共102页，2024年2月25日，星期天第13页,共102页，2024年2月25日，星期天142.细胞凋亡的生物学特征形态学变化生物化学变化

胞内Ca++浓度增高

DNA片段化大分子的合成(凋亡相关蛋白质及RNA合成）

tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。一种依赖钙离子的酶，当凋亡起始时，Ca++浓度上升，从而使tTG活化。其作用是保持凋亡小体的完整性，防止有害物质的逸出。第14页,共102页，2024年2月25日，星期天15MorphologicalChanges(细胞生物学详讲)第一阶段：胞体缩小与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小块。第二阶段：染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。第三阶段：凋亡小体被邻近的巨噬、上皮细胞等识别、吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。第15页,共102页，2024年2月25日，星期天16细胞凋亡时的形态学变化第16页,共102页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡与细胞坏死特征细胞凋亡细胞坏死诱导因素生理及弱刺激强烈刺激受累范围

单个细胞丢失成群细胞死亡膜完整性保持到晚期早期即丧失细胞体积减少、固缩增大肿胀染色质凝聚成半月形稀疏成网状细胞器无明显变化肿涨破坏溶酶体保持完整破坏外溢细胞形状形成凋亡小体破裂成碎片基因组DNA有控降解随机降解大分子合成一般需要不需要基因调控有无后果不引起炎症反应引起炎症反应意义生理死亡方式病理死亡方式17第17页,共102页，2024年2月25日，星期天18第18页,共102页，2024年2月25日，星期天19第19页,共102页，2024年2月25日，星期天20DNA'ladderDNAfragmentationchromatinDNAcorehistonenucleosome180bpendonucleolytic第20页,共102页，2024年2月25日，星期天213.细胞凋亡的诱导和抑制因素物理性因子，包括射线（紫外线，

射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等；化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子

（TNF

）等。

DNA和蛋白质合成的抑制剂等。

第21页,共102页，2024年2月25日，星期天224.免疫相关的凋亡信号转导接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的级联反应第22页,共102页，2024年2月25日，星期天23免疫相关的凋亡信号途径死亡受体介导的信号途径线粒体途径颗粒酶B途径(CTL特有)第23页,共102页，2024年2月25日，星期天24死亡受体通路、线粒体通路第24页,共102页，2024年2月25日，星期天25其中膜受体和线粒体途径均通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸酶（Caspase）剪切胞内底物（Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程），导致凋亡特有的生化和形态学改变。细胞凋亡涉及的共同通路第25页,共102页，2024年2月25日，星期天26Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的词头)细胞凋亡涉及的共同通路第26页,共102页，2024年2月25日，星期天27第27页,共102页，2024年2月25日，星期天28Caspase家族的结构与分类ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；

Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11

Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡启动亚类Caspase蛋白酶（上游Caspase）：

Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效应亚类Caspase蛋白酶（下游Caspase）：

Caspase3，Caspase6，Caspase7第28页,共102页，2024年2月25日，星期天29

Caspase家族的特点：以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用C端同源区存在半胱氨酸激活位点

第29页,共102页，2024年2月25日，星期天30Caspase活化机制：

Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,第30页,共102页，2024年2月25日，星期天31第31页,共102页，2024年2月25日，星期天32凋亡细胞的特征性表现：包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。破坏细胞抗凋亡因素破坏细胞结构影响核酸的结构与功能Caspase的效应机制第32页,共102页，2024年2月25日，星期天33破坏细胞抗凋亡因素正常活细胞内核酸酶处于无活性状态。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起（如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）。现知caspase可以剪切裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需的。

第33页,共102页，2024年2月25日，星期天34破坏细胞结构

Caspase可直接破坏细胞结构：如裂解核纤层

核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。第34页,共102页，2024年2月25日，星期天35影响核酸的结构与功能Caspase可作用于多种与DNA、RNA功能有关的蛋白：如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。第35页,共102页，2024年2月25日，星期天364.1

死亡受体的信号转导(1).参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白

TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白

FasL+Fas（死亡结构域）+FADD细胞凋亡RIP：受体相互作用蛋白CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白第36页,共102页，2024年2月25日，星期天37(2).死亡受体通路受体多聚化和构像改变死亡受体/配体/FADD/Caspase8或10+FADDFASL+FAS凋亡诱导复合物（DISC）胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8细胞caspase8浓度不够死亡受体活化，细胞凋亡切割BidtBid从胞质到线粒体CtyC释放线粒体途径第37页,共102页，2024年2月25日，星期天38FasL//Fas第38页,共102页，2024年2月25日，星期天39(3).死亡受体途径的调控机制FLIP

[FADD-like-IL-1β-converting-enzyme(FLICE)inhibitoryprotein]

近年发现的含DED的凋亡抑制蛋白广泛存在于真核生物、哺乳动物细胞和病毒中包括：病毒基因编码的FLIP(v-FLIP)

细胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL

功能：抑制Caspase8结合到DISC上，从而抑制起始Caspase激活。第39页,共102页，2024年2月25日，星期天404.2线粒体途径(1).基本环节：释放caspase活化因子细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+caspase9凋亡体AIF（凋亡诱导因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子第40页,共102页，2024年2月25日，星期天41(2).线粒体通路第41页,共102页，2024年2月25日，星期天42(3).线粒体通路的调控机制Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）

因该家族成员可通过改变外膜通透性而调控线粒体活化，故该途径也称为Bcl-2介导的线粒体途径。

Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。

第42页,共102页，2024年2月25日，星期天43根据结构和功能分为两类：抗凋亡/促增殖成员：包括Bcl-2、Bcl-xl等。

机制：可阻止线粒体外膜通透化，从而阻止细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。促凋亡成员：包括Bid、Bim、Bad等“BH3only”蛋白质和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白质机制：影响APAF1的功能影响线粒体的结构与功能第43页,共102页，2024年2月25日，星期天44第44页,共102页，2024年2月25日，星期天45第45页,共102页，2024年2月25日，星期天46IAP（inhibitorofapoptosis，细胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成员较多，共同的特征是含有一个或多个７０个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。

BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-３和-７的泛素化降解作用。第46页,共102页，2024年2月25日，星期天47第47页,共102页，2024年2月25日，星期天48(3)Smac/Dablo

在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。成熟的Smac蛋白产生一个新的N基端,这个N基端的前面4个氨基酸可以与lAP的BIR结构域结合。

Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9与lAP的结合。Smac与BIR2的结合可以中和XlAP对胱解酶9的抑制，促进凋亡。第48页,共102页，2024年2月25日，星期天49(4)AIF(apoptosis-inducingfactor)EndoG

两者均由线粒体释放，可以非Caspase依赖方式介导染色质的浓集和DNA片段化，促进凋亡。第49页,共102页，2024年2月25日，星期天50

颗粒酶B途径凋亡颗粒酶B属丝氨酸蛋白酶可作用于底物的天冬氨酸残基位点是CTL杀伤靶细胞的主要效应分子。机制:(1)颗粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞内底物介导凋亡

(2)颗粒酶B剪切Bid而产生tBid,后者与Bax转位于线粒体，介导细胞色素C释放，激活Caspase级联反应。第50页,共102页，2024年2月25日，星期天51细胞凋亡发生于在淋巴细胞分化、发育成熟及增殖和行使免疫学效应的全过程中；细胞凋亡在免疫系统成熟、受体多样性选择以及免疫自稳等方面均有重要作用；研究免疫系统凋亡机制将为探讨包括肿瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相关疾病的发生机理进而发展有效的防治方案提供依据。二细胞凋亡与免疫生理第51页,共102页，2024年2月25日，星期天52二细胞凋亡与免疫生理1.细胞凋亡与T细胞（1）凋亡与T细胞在胸腺的分化发育：第52页,共102页，2024年2月25日，星期天53（2）凋亡与成熟T细胞：活化T细胞表面高表达fas及fasL。AICD1.细胞凋亡与T细胞第53页,共102页，2024年2月25日，星期天542.细胞凋亡与B细胞（1）凋亡与骨髓中B细胞发育：（2）凋亡与成熟B细胞第54页,共102页，2024年2月25日，星期天553.细胞凋亡与淋巴细胞的细胞毒作用：有胞毒作用的淋巴细胞主要有CTL、NK、LAK细胞等。它们产生效应的机制相似：Ca+内流→释放穿孔素→6-16nm孔→靶细胞死亡

靶细胞凋亡↑颗粒酶（丝氨酸酶）→激活caspase←TNF相关蛋白↑

Tc高表达FasL第55页,共102页，2024年2月25日，星期天三细胞凋亡与免疫病理细胞凋亡不足及细胞凋亡过度都会造成疾病20040481proliferationapoptosishomeostasis

time第56页,共102页，2024年2月25日，星期天57与凋亡不足有关的疾病与凋亡过度有关的疾病1肿瘤1AIDS滤泡型淋巴瘤2神经变性疾病激素依赖性肿瘤（乳瘤）巴金森氏病2自身免疫病色素性视网膜炎系统性红斑狼疮3再生障碍性贫血免疫介导的肾小球肾炎4缺血性损伤3病毒感染心肌梗死，中风疱疹病毒，腺病毒5酒精中毒性肝病57凋亡不足与过度并存：动脉粥样硬化（内皮细胞凋亡过度，血管平滑肌细胞凋亡不足）第57页,共102页，2024年2月25日，星期天58针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞凋亡的措施治疗有关的疾病：1诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病放疗和化疗能激活肿瘤自杀程序，导致瘤细胞凋亡。改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。一个十分诱人的设想是基因治疗——通过载体导入凋亡相关基因干预细胞的凋亡调控来实现。2抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病

神经生长因子治疗神经系统退行性病变，可以延缓神经元凋亡。第58页,共102页，2024年2月25日，星期天59四细胞凋亡研究方法形态学方法生物化学方法免疫学方法组织化学方法分子生物学方法第59页,共102页，2024年2月25日，星期天60第60页,共102页，2024年2月25日，星期天611.形态学方法1）

光学显微镜观察

样品涂片或组织切片经常规处理、HE染色后,即可放在油镜下观察。该方法简便,缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定为荧光结果阳性,因而不易检出早期的凋亡细胞,而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死)与细胞凋亡形态相似,两者不易区分。因此,该方法只能作为细胞凋亡初步推测的手段。第61页,共102页，2024年2月25日，星期天62第62页,共102页，2024年2月25日，星期天631.形态学方法2）荧光显微镜观察：荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等染色,在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测,组织脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察。荧光显微镜检查法方便易行,现已成为细胞凋亡检查的常用手段。第63页,共102页，2024年2月25日，星期天64

Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown.InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindoledihydrochloride)hasbeenused,whichspecificallystainsDNA.

第64页,共102页，2024年2月25日，星期天65

1.形态学方法3）透射电子显微镜观察：凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小,细胞质浓缩,内质网、线粒体增多,细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。但该法只能定性,不能定量,而且观察到凋亡小体的几率也不高,在体内试验时,凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除,而不易观察到;此外,用电子显微镜检测细胞凋亡,样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。第65页,共102页，2024年2月25日，星期天66第66页,共102页，2024年2月25日，星期天671.形态学方法4）共聚焦激光扫描显微镜检测：共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型仪器,是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使紫外光和可见光激发荧光探针,从而得到清晰的细胞内部结构。该方法能用于细胞的形态学分析,而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位。第67页,共102页，2024年2月25日，星期天682.生物化学方法：（1）典型的细胞凋亡显示出DNA梯形电泳图谱：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180～200bp长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱,而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状第68页,共102页，2024年2月25日，星期天69细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker

（自赵允、翟中和）第69页,共102页，2024年2月25日，星期天70第70页,共102页，2024年2月25日，星期天712.生物化学方法：（2）原位末端转移酶标记技术：

凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。第71页,共102页，2024年2月25日，星期天72

2.生物化学方法：

由DNA片段末端标记技术发展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltransferase(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabelling,TUNEL]及试剂盒化,使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。第72页,共102页，2024年2月25日，星期天73TUNEL法原理

1.细胞凋亡其断裂DNA断端3′-OH暴露(坏死细胞DNA断裂是无规则的,其中也有少数可出现3′-OH的暴露,但数量极微弱,不易检测出来);

2.在末端DNA转移酶(TdT)的作用下,在无需模板的情况下,可进行3′端的DNA合成;

3.如果在反应体系中加入标记的DNA,则在3′端出现一段带有标记物的寡核苷酸,通过荧光显示或其他显色反应,可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。第73页,共102页，2024年2月25日，星期天74TUNEL法优点:①特异性:该法用生化方法特异地标记凋亡细胞,可以将凋亡细胞、坏死细胞和活细胞区分开来。凋亡细胞显示增强的荧光,而坏死细胞和活细胞均不着染荧光。②敏感性:TUNEL法可用于只有极少细胞发生凋亡的情况。③可定量检测细胞凋亡。第74页,共102页，2024年2月25日，星期天75TUNEL法优点:④适用于形态研究:用TUNEL法标记细胞可动态观察凋亡细胞的超微结构变化。⑤适用性较广:可用于石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离细胞的凋亡情况检测。⑥TUNEL法检测快速,其反应过程仅需3h。第75页,共102页，2024年2月25日，星期天76第76页,共102页，2024年2月25日，星期天77第77页,共102页，2024年2月25日，星期天78缺点:①只能标记中期及晚期的凋亡细胞。②不能检测只发生DNA大片段(300000bp)断裂的凋亡细胞。③不能检测DNA断裂末端的准确数量,因为每个末端结合的标记分子的数量可因反应动力学而不同。④若样品处理不当,易形成假阳性,影响结果判断。第78页,共102页，2024年2月25日，星期天793.免疫学方法(ELISA法)

利用“夹心酶标免疫测定法”的原理,核小体DNA由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解，用抗组蛋白（或抗DNA）-过氧化物酶（或生物素化的抗体）结合到核小体，通过酶标仪分析,可定量反映细胞凋亡水平。第79页,共102页，2024年2月25日，星期天80核小体酶底物第80页,共102页，2024年2月25日，星期天81ELISA方法的优点是:灵敏度高,操作快捷,无放射性同位素污染,可定量测定细胞凋亡,无需预先标记细胞,所用抗体不具有种属特异性,酶标记的抗DNA抗体可与单链和双链的DNA起反应。夹心法可以测定核小体单体和寡聚核小体，因而可以用于许多不同的培养细胞株或动物组织细胞的凋亡检测。第81页,共102页，2024年2月25日，星期天824.组织化学方法：细胞凋亡的相关蛋白分析:如p53蛋白、c-myc、Fas、Bcl-2家族蛋白等。测定方法主要有流式细胞仪检测法、蛋白印迹法及免疫组织化学染色法等。第82页,共102页，2024年2月25日，星期天835.分子生物学方法：

PCR是检测凋亡特异性基因的常用方法。

PCR被用来扩增凋亡细胞产生的DNA片段,当琼脂糖凝胶电泳呈现的DNA梯形条带不明显时,用PCR扩增后再电泳可见明显的梯形图谱；

RT-PCR被用来检测Bcl-2和caspase表达；荧光定量PCR检测基因表达水平更快更准确。此外,将PCR技术和核酸分子杂交技术相结合,能显著提高检测的特异性和灵敏度。第83页,共102页，2024年2月25日，星期天846.流式细胞分析术(flowcytometry，FCM)第84页,共102页，2024年2月25日，星期天85

亚“G1”峰检测法:处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相(G0／Gl、S、G2／M)，其DNA含量分布在2n—4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜而丢失，仅剩下大片段DNA，这些失去部分DNA含量的细胞，在DNA染色后，形成一个DNA含量<2n(即<G1期细胞)的分布区，称为“亚G1峰”。6.流式细胞分析术(flowcytometry，FCM)第85页,共102页，2024年2月25日，星期天86第86页,共102页，2024年2月25日，星期天877.细胞凋亡的其它检测:PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测:

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V(Ca2+依赖性磷脂结合蛋白)能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。细胞内氧化还原状态改变的检测：

CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。第87页,共102页，2024年2月25日，星期天88细胞色素C的定位检测：通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。线粒体膜电位变化的检测：端粒酶检测：mRNA水平的检测：蛋白印迹法:检测细胞凋亡的相关蛋白分析:如caspase、Fas家族蛋白等.7.细胞凋亡的其它检测:第88页,共102页，2024年2月25日，星期天89

细胞凋亡检测技术存在的问题

（1）细胞凋亡的判断标准:目前,检测细胞凋亡的许多方法的结果判断标准不一。形态学检查是其他各种检测方法的基础,任何方法的检查结果必须结合形态学检查来判断。梯带状图像并不必然与细胞凋亡相关;TUNEL法在坏死细胞群中也可出现阳性细胞。第89页,共102页，2024年2月25日，星期天90（2）细胞凋亡检测结果分析:

在一个检测体系中检出了发生凋亡的细胞,生理性还是病理性，需进行致病因素的相关性分析.

细胞凋亡检测技术存在的问题

第90页,共102页，2024年2月25日，星期天91

细胞凋亡检测技术存在的问题

（3）细胞凋亡的定量分析：定量分析包括2个方面,一是群体细胞凋亡的定量,二是细胞凋亡程度的定量。目前,流式细胞仪常用作群体细胞凋亡的定量分析,但在检测中的漏检率和错检率都很高。TUNEL法虽可进行群体定量,但工作量大,同时易出现坏死细胞的假阳性。第91页,共102页，2024年2月25日，星期天92展望第92页,共102页，2024年2月25日，星期天93☆现代生命科学的发展动态

细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗透与交融是总的发展趋势。

（细胞凋亡研究所处的地位）第93页,共102页，2024年2月25日，星期天94生命科学的研究从宏观上可以分为

三个层次：

核心层次（包括分子生物学和细胞生物学学科）

个体生物学层次（对多个物种及种群的结构及功能研究）生物圈层次。无论是对细胞结构和功能的深入研究，还是对细胞重大生命活动规律的探索，都需要用分子生物学的新概念与新方法，在分子水平上进行研究，换句话说，细胞分子生物学或分子细胞生物学将是今后相当一段时间的主流。第94页,共102页，2024年2月25日，星