两种猪腹泻相关病毒病原学特征研究

两种猪腹泻相关病毒病原学特征研究仔猪腹泻持续在中国、韩国以及美国等地爆发,发病仔猪呈现腹泻、呕吐等症状,严重的能导致仔猪迅速脱水而引起死亡,死亡率较高,给养猪产业带来了巨大经济损失。目前,引起仔猪腹泻的病原还没有完全弄清,各国学者普遍认为猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV),猪传染性胃肠炎病毒(TransmissibleGastroenteritisViru,TGEV),轮状病毒(Rotavirus,RV)以及其它肠道病毒性病原等为猪腹泻的主导。但是一些免疫过的猪场又会重新暴发腹泻,该现象引起各国学者反思。近年来一些新发腹泻病毒如猪丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV),哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalianorthoreovirus,MRV)等先后被报道,引起了人们的关注。本研究主要对两株新分离猪腹泻相关病毒的生物学特征开展了一系列研究。2013年,作者从腹泻仔猪粪便中分离到一株能在Vero细胞上增殖,并引起细胞肿胀、变圆等病变的未知病毒。通过RT-PCR检测,PEDV、TGEV、PDCoV以及RV均呈阴性,最终利用高通量测序技术确定该病毒为3型呼肠孤病毒,命名为MRV-ZJ2013。病毒大小约70-100nm、无囊膜,感染细胞后整齐排列在细胞质中。MRV-ZJ2013毒株感染Vero细胞(MOI=0.01)后呈“S”型增长,在感染后第36h病毒量达到最高值(108.33TCID50/mL),随后进入平台期。MRV-ZJ2013对温度和紫外线比较敏感,在100℃处理1h或254nmUV照射30min后病毒完全失活。致病性试验显示,MRV-ZJ2013毒株感染组出生仔猪后出现轻微腹泻、软便、食欲不振等现象,有部分试验猪(3/6)在感染后的第1或2d有排毒现象。感染后,仔猪体内抗MRV3IgG水平显著升高,直到感染后第14d,体内仍能检测到抗体。宰杀症状明显的仔猪,解剖发现其肠系膜轻微充血。组织病理切片显示MRV3感染组有小肠绒毛表层脱落,内层出现空洞等现象。免疫组化染色显示肠绒毛上存在病原。上述结果表明,MRV-ZJ2013毒株毒力较弱,尽管能够产生免疫应答,但不能引起明显症状。分子克隆MRV-ZJ2013基因组10个片段并上传至GenBank中(登录号为KY419120至KY419129)。MRV-ZJ2013毒株L1,M2,S1节段与3型代表株T3D相似度最高,其它的7个片段与1型代表毒株(T1L)相似度最高。氨基酸序列对比结果相似,λ1,μ1,μNS和σ1蛋白(分别由L1,M2,M3和S1编码)氨基酸序列与T3D毒株序列相似度最高,其它蛋白氨基酸序列与T1L毒株相似度最高。与所有已发表的猪MRV基因组序列比较分析发现,MRV-ZJ2013毒株与美国毒株相似度最低;MRV-ZJ2013毒株S1基因进化树结果显示其属于血清型3型,与亚洲分离的猪呼肠孤病毒亲缘关系最近;MRV-ZJ2013毒株基因组中有5个片段(M1,S3,M3,S2和S4)与中国蝙蝠MRV亲缘关系最近,L3,M2和S1与猪MRV亲缘关系最近,而L1和L2基因则与水貂MRV亲缘关系最近。将10个阶段串联之后利用RDP4重组分析,结果显示MRV-ZJ2013毒株S2,S3,L2,L3,M2,S1等片段存在重排,重排亲本可能来源于蝙蝠MRV、猪MRV、水貂MRV和未知来源MRV。因此,推测MRV-ZJ2013毒株可能是由蝙蝠MRV,猪MRV以及水貂MRV基因组重排而来。针对L1基因设计特异性引物建立猪呼肠孤病毒巢式RT-PCR检测方法,对从浙江、江西、山东、河南、黑龙江等省58个猪场共采集224份腹泻仔猪粪便样品进行检测。结果显示55个猪场(55/58,94.8%)共检出147个阳性样品(147/224,65.6%),其中第一轮从16个猪场检出阳性样品28个(28/224,12.5%)。建立基于衣壳蛋白δ1蛋白为包被抗原的间接ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测方法,并检测从江苏、湖南、江西、河南、浙江、黑龙江和山东等省收集的1037份不同年龄段猪血清样品,MRV3抗体检出率为77%(OD450nm平均值为0.69±0.32)。母猪和1周龄以内仔猪血清样品阳性率和抗体平均水平都最高,后备母猪抗体水平最低。东部各省中,黑龙江省样品阳性率以及抗体平均水平均低于其它省份,而其它省份之间差异不显著。综合上述数据,本研究认为MRV广泛存在于中国东部猪场。猪丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus)属冠状病毒科(Coronaaviridae),冠状病毒亚科(Coronaviriaae),是近年来新发现的一类冠状病毒,能感染各年龄段的猪群,引起腹泻、呕吐和脱水症状。本研究利用体外模型对PDCoV在细胞内复制过程进行研究。PDCoV感染5h后,细胞外开始检测到病毒,说明此时子一代病毒完成组装并释放到胞外。透射电镜观察PDCoV在细胞内复制过程发现,PDCoV通过膜融合进入细胞,随后在细胞质中复制和翻译。病毒在内质网和高尔基体中间体(ERGIC)完成病毒组装,随后被转运到高尔基体中完成“成熟”过程,最终被囊泡运输排出细胞。PDCoV感染LLC-PK1和IPEC-J2细胞引起细胞内膜重排(Membraner