生物医药相关技术及生物学基础论文

生物医药类相关技术1.特发性血小板减少性紫癜治疗药物——罗米司亭项目简介：特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)是一种常见的出血性疾病,系免疫系统引起的血小板破坏过多和巨核细胞导致的血小板减少所致的出血综合征。其中包括自身抗体引起的血小板减少以及同种类型抗体介导的免疫性血小板减少症(immunethrombocytopenicpurpura)两部分。在美国,估计6万患者被诊断慢性ITP,在欧洲原发的ITP估计每年每百万人有50～100例新患者。ITP患者经常由于小血管撞伤、挫伤、鼻出血、牙科手术等轻度出血难以停止,发展为更严重的出血甚至可威胁生命。正常的血小板计数应为150×109～400×109/L。血小板计数<150×109/L为血小板减少症,而血小板计数<50×109/L具有高度危险,容易引起出血并发症。慢性ITP的致病机制与自身免疫异常造成的血小板破坏或由于骨髓功能不全导致的血小板产生不足有关。此外,化疗和慢性肝脏疾病也可引起血小板减少。当前的治疗采用大剂量糖皮质激素、免疫球蛋白和抗D球蛋白、环孢素等免疫抑制剂、化疗药环磷酰胺、长春花碱或抗人CD20单克隆抗体利妥昔单抗。但很多ITP患者会复发,且这类治疗不良反应较多,对难治性病例还要进行脾切除手术,但是容易出现感染等并发症,故临床需要更加安全有效的治疗方法。2008年8月,美国FDA批准Amgen公司的罗米司亭(romiplostim,Nplate,AMG531)上市,用于治疗经糖皮质激素类药物、免疫球蛋白或脾切除术治疗无效的慢性ITP患者,罗米司亭只能用于血小板减少症出血危险增加的ITP患者。罗米司亭产生自大肠杆菌,系利用重组DNA技术制成的能刺激血小板生成的Fc肽融合蛋白。本品分子包含2个相同的单链亚单元,每个单链包含IgGFc恒定区域和TPO模拟肽。Fc段能有效地延长药物半衰期。而TPO模拟肽与羧基端通过共价键链接,包含2个TPO受体结合区域,具有血小板生成素活性,能和巨核细胞表面的TPO受体结合,活化细胞内通路,使血小板增加,而且与TPO没有序列同源。技术创新点:目前分别构建了大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，二者都实现了高效表达，大肠杆菌表达量在占菌种总蛋白30%左右，以包涵体形式表达，经过变、复性，得到有活性的重组蛋白。毕赤酵表达量在1.5g/L左右，重组蛋白经纯化用去糖基化酶去除糖链，得到与上市罗米司亭结构完全一致的蛋白。发酵和纯化小试也已完成了，近期准备中试。合作方式：转让或合作2.年龄相关性黄斑变性——雷珠单抗项目简介：赖新生血管来供应肿瘤的营养。眼部的许多疾病都涉及血管发生，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变(DR)视网膜新生血管和早产儿视网膜病等。在正常情况下内源性血管形成促进因子和抑制因子处于平衡状态，如果这种平衡被打破就会导致眼部新生血管性疾病的发生，如当眼球缺血、缺氧，相对的组织细胞会释放一些与血管增生相关的物质。VEGF被认为是血管发生的关键因素，人VEGF基因位于6p213，全长28kb，编码VEGF基因约14kb，基因由交替剪接的8个外显子、7个内含子组成，编码产物分子质量为(34~45)103的同源二聚体糖蛋白。VEGF家族包括7种:VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和胎盘生长因子，它们都分泌多肽，有相似的结构单位，但生物学和物理学性质不同。VEGF现在已知的至少有6个亚型，通过RNA的剪切拼接产生不同的异构体，分别为VEGF206，VEGF189，VEGF183，VEGF165，VEGF148，VEGF145和VEGF121，VEGF165为最主要的异构体，体外可促进内皮细胞分裂生长，体内可诱导新生血管生成，导致视网膜血管增生和渗透性增加。VEGF广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、眼等多种组织，一般在眼部视网膜的周细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞均有VEGF存在，对维持眼部血管完整性起了重要的作用，但过度表达会促进血管增殖。年龄相关性黄斑变性(AMD)患者的微血管膜发现有VEGF-165和VEGF-121，动物实验也证实了VEGF-165在炎症、白细胞诱导和神经对抗缺血性伤害方面起了一定的作用。AMD是引起脉络膜新生血管(CNV)的最常见的疾病，也是VEGF抑制剂治疗的首要眼部疾病。病变开始是干性AMD，特征是视网膜色素上皮层硫黄色颗粒形成和色素变，视网膜萎缩严重影响视力。湿性AMD，以CNV为特征，经常引起黄斑水肿、渗出和纤维化，导致视力丧失。只有10%的AMD患者有CNV，但几乎90%的CNV的患者都有严重的视力损害。有关资料证明，患者在干性AMD进展期的时候用大剂量的抗氧化剂效果很好，锌和高剂量抗氧化剂(维生素C、E和胡萝卜素)能减少发生视网膜萎缩和CNV，患者的视力损害也较轻。近年来，在AMD的发病机制和治疗方面已经有了突飞猛进的发展，AMD新生血管是目前治疗的焦点。光凝固疗法的研究显示热激光对异常血管治疗较好，但是这种疗法由于光斑密度和结构不同，在治疗视力丧失方面有一定的局限性。光动力学疗法(PDT)是用激光激活感光燃料封闭CNV，PDT能阻止患者的视力丧失，但不能明显地改善视力。VEGF抑制剂能明显改善湿性AMD的治疗效果，有关资料表明CNV的形成是与VEGF的水平相关。由于人们发现VEGF在新生血管的发生和发展中起主要作用，所以围绕VEGF的药物不断出现。雷珠单抗（Ranibizumab）是所有特异性人类VEGF亚型单克隆抗体片段的重组体。Ranibizumab对人类VEGF有高亲和力，通过产生中和效应抑制VEGF和受体的相互作用。在灵长类动物实验中，通过激光诱导脉络膜新生血管，玻璃体内注射Ranibizumab减少新生血管的发生率和血管渗透性。在另一份临床实验中，AMD患者随机接受常规护理或者玻璃体注射300g或500granibizumab，每28天注射1次，共4次，Ranibizumab治疗过程中除了有眼部炎症没有其他不良反应的发生。300g组在第98天和21天的视力测定有明显提高，同时，常规护理组患者在第98天视力有下降，第99天开始接受ranib-izumab治疗，第210天发现视力有所提高。美国FDA在2006年6月批准Ranibizumab用于治疗AMD和黄斑水肿。2006年，Ranibizumab的上市被评为美国的十大卫生新闻。上市以后，在销售额上，Ranibizumab也表现不俗，很快就挤身重镑炸弹级药物行列，2010年31.06亿美元，2011年37.23亿美元，2013年更是达到了39.75亿美元，排在生物药的第8位。2010年，诺华在中国申请进口药物的注册，目前还在审批阶段。技术创新点:适应症：年龄相关性黄斑变性(AMD)、脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变(DR)视网膜新生血管和早产儿视网膜病等Ranibizumab的专利将于2018年到期，我们于2011年启动仿制研究。目前，我们已完成高表达菌株构建、大规模发酵和纯化工艺小试研究。本项目已完成表达菌株构建、小试生产工艺研究，通过大肠杆菌分泌表达，成本低，表达量0.2g/L以上。合作方式：转让或合作3.长效升白细胞药物——PEG-GCSF项目简介：中性粒细胞（ANC）减少症是化疗所致骨髓抑制最常见也是最严重的一种并发症，可增加患者感染的危险性，导致化疗剂量减少、时间延误。研究显示，约25%～40%接受常规化疗的肿瘤患者会出现中性粒细胞减少性发热；当ANC<1500/mm3时，感染危险性增加；当ANC<500/mm3时，严重感染危险性明显增加；当ANC<100/mm3时，10%～20%甚至可能更多的患者会发生菌血症。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）的上市解决了这个难题，可使肿瘤化疗患者白细胞迅速恢复，从而能够给病人更高的化疗剂量，同时本品也可以作为预防中性粒细胞（ANC）减少症应用。目前rhG-CSF制剂需要多次注射，使用不便。因此，如何在达到相同疗效的基础上，减少患者的药物注射次数，让他们在比较安全、减少痛苦的情况下接受化疗，一直是临床关注的重点问题。长效PEG-rhG-CSF是由一个20KDa的聚乙二醇（PEG）分子选择性地与rhG-CSF蛋白质N末端定点交联而成，通过PEG修饰从而延长其在体内的代谢时间（其血浆半衰期可延长至47小时），达到减少注射次数的目的。每个化疗周期只需用药一次，可避免反复注射rhG-CSF给病人带来的痛苦，以及长时间医患接触带来的感染可能；另外，PEG分子没有毒性和免疫原性，并可被肌体安全清除，从而使药物的免疫原性和抗原性降低，提高了安全性；PEG化使药物溶解性增加、生物利用度提高、制剂稳定性增强，其升白作用更平稳，可避免每两天检查血常规，并使多周期标准化疗方案成为可能；同时，也可减少住院时间、提高医院病床周转，使患者门诊化疗成为可能。大量临床研究结果显示，一个化疗周期注射一次PEG-rhG-CSF与多次注射rhG-CSF，在预防粒细胞减少症上疗效相同，但其不良反应明显减少。因而长效PEG-rhG-CSF具有很好的临床应用潜力。技术创新点：本项目，与有关研发企业合作，参考国内外相关的专利和文献，成功攻克PEG化G-CSF难题，取得了以下进展。(1)工艺简单可靠，修饰率高。在现有的G-CSF基础上，经过一步修饰，即可获得PEG化G-CSF，比活性不低于3.0×107IU/mg蛋白，与已上市“津优力”和“培非司亭”相当(2)原液电泳纯度和HPLC纯度不低于95%，残留甲氧基聚乙二醇丙醛（PEG）含量不高于5%(3)修饰后纯化工艺简单可靠，收率高。经过粗提纯、精提纯、精提液的浓缩及过滤除菌等步骤，纯化收率约80%(4)建立了完善的工艺标准规程，提供相关的原辅料、半成品原液质量标准(5)提供相关的设备、填料类型等帮助，帮助生产企业尽快开展相关工作(6)可提供有关制剂的相关技术指导，协助生产企业尽快完成有关的制剂研究工作合作方式：转让或合作4.秸秆制生物可降解塑料前体L-乳酸项目简介：L-乳酸是制造生物可降解塑料的原料，以往都是用玉米为原料，存在与人争粮的矛盾。另一方面玉米秸秆大量存在，成为一个污染物，为防止农民燃烧秸秆，各级政府每年投入大量人力物力。用秸秆替代粮食生产L-乳酸是个很好的设想，本实验室已经将其变为现实，生产成本比用玉米为原料相当或更低，每3.5吨秸秆可产1吨L-乳酸。该项目具有很大创新性，全球范围内还未见有产业化实施报道。该项目已拥有三项相关发明专利，ZL201110109682，ZL2012104080186，ZL201410060025.0，形成了较高的竞争壁垒，还有至少两项专利待申请。秸秆与粮食一样含有70%的糖类，只是这些糖连接的方式不太一样，更难水解，还有一半是使戊糖。本项目利用化学和酶解方法获得葡萄糖和戊糖，再发酵为L-乳酸。相关原料所带来问题都得到很好解决。技术创新点：在最经济的条件下，每3.5吨秸秆可产1吨L-乳酸。创新点是采用未曾工业化使用的新原料。合作方式：技术转让、技术入股5.无痛内镜专用呼吸三通管项目简介：无痛内镜专用呼吸三通管是2013年3月本品为一次性医疗耗材，主要用于无痛内镜诊疗必需的供氧环节，以河南省人民医院为例，2014年度，无痛内镜达4万余例，如能应用于全省乃至全国各级医院，将是一个广阔巨大的市场空间，本品拥有国家实用新型专利证书，在研发过程中多次征求麻醉专业、内镜专业权威人士建议和意见，反复修改，结构设计成熟，技术方面认可度高，加之结构并不复杂，原材料采用合成树脂，无需巨额资金的投入。在医械准入方面，由于不与患者直接接触，故相对容易通过审批，拿到资质后，即可大量生产，产生效益。技术创新点:采用合成树脂制成，面罩连接管直径为22mm，螺纹管连接处直径为22mm，活瓣开口处直径约8mm。主要创新点：呼吸面罩是在手术麻醉或抢救呼吸骤停的患者时，为患者提供氧气的一种辅助呼吸装置，该装置通过与呼吸机或者呼吸囊的联通，给患者供氧，这一操作通常由麻醉医师来完成。传统呼吸面罩的接头只有一种连接方式，一端与面罩相连，一端与呼吸囊或者呼吸机相连，所以在使用无痛内镜设备，比如胃镜或纤支镜时，就必须将面罩摘掉，不能达到不间断供氧的目的，因此会影响手术的进展，甚至延误宝贵的抢救时间。本三通管主管的下端与呼吸面罩相连接，面罩罩于患者面部，另一端的螺纹管连接管可与连接呼吸囊或者呼吸机，以供氧。当需要使用无痛内镜设备时，内镜设计可以通过主管顶端的连接孔插入，经过面罩进入患者口腔并至体内，可以更加方便快捷的完成检查和治疗工作。成功解决了在进行无痛内镜检查时时，面罩会与患者面部脱离，造成供氧不足的问题，不会影响麻醉过程中对于呼吸道的管理。主管上端的内窥镜连接孔由活瓣覆盖，该活瓣由硅胶材质制成，具有良好的收缩和紧闭性，当不需要呼吸囊或者呼吸机供氧时，活瓣会自动封闭，如果需要使用无痛内镜时，可将内镜从活瓣处直接插入，不会妨碍供氧管道的使用。内镜通过的管道较短，由于硅胶活瓣具有良好的弹性，所以内镜在管道内可以任意角度旋转，而且构造简洁，体型小巧，制作成本较低。可适用于一般普通面罩，不需另行配置特殊面罩。主要风险：本产品实用性强，在国内尚无产品普及，有着巨大的市场需求和空间，市场风险不大。合作方式：转让或合作6.口服避孕药屈螺酮的新制备工艺项目简介：屈螺酮是第四代女用口服避孕药的代表药物，由德国先令公司(ScheringAG)开发，其与雌二醇或炔雌醇组成的复方制剂安全有效，副作用小。自2000年在欧洲上市以来，已成为全球销量第一的女用口服避孕药。为降低屈螺酮的生产成本，本课题组采用化学方法结合生物转化方法，以去氢表雄酮为起始原料，9步制得屈螺酮，使制备工艺大大简化，收率达到国内领先水平。该路线所用菌株具有自主知识产权，并且合成工艺先进，操作简单，绿色环保，具有大规模工业生产的潜力。该路线的小试总收率可达到25%左右，接近文献报道的最好收率。应用前景：中国零售药品研究发展中心（MDC）的统计数据显示，2009年国内避孕药零售销售比2008年增长了13.5%，且近年来一直呈上升趋势，说明口服避孕药在我国也越来越受到认可和接受。但是该药目前还是进口药品，在国内的售价较高，是同类药品的5-6倍，属于高附加值的甾体激素类药物。本项目的实施可以使屈螺酮的生产成本降低50%以上，可为实现屈螺酮的大规模工业生产奠定基础，并且对开发高端激素药物，促进我国激素制药工业的发展产生深远意义，具有潜在的巨大的社会和经济效益。关键技术路线如下：合作方式：技术转让关于物种形成的理解摘要：本文就物种的概念、形成方式、形成原因进行了一定的研究与思考，重点考虑了地理成种和非地理成种两种成种方式。物种形成是指由物种通过各种机制进化出新物种的过程，是进化生物学领域最基本也是最重要的问题之一。从根本上来说，物种形成是生物学多样性产生的基本机制。尽管达尔文在《物种起源》中就已经提出，自然选择是物种形成的主导因素（Darwin,1859）,但一直以来，物种形成过程一般被认为是由随机过程导致的。直到生殖隔离的概念被提出，自然选择在物种形成中的作用才重新受到重视，并认为物种形成是与地理因素存在着重要的关系。本文对物种形成进行了较为详细的介绍，并就在生殖隔离与物种形成方式上进行较为详细的论述。关键词:物种形成；生殖隔离；地理成种；非地理成种；。Abstract：Inthispaper,thespeciesoftheconcept,formandformingreasonwasresearchandthinking,mainlyconsideringthegeographyintospeciesandgeographicalintotwoways.Speciationreferstotheprocessofnewspeciesevolvebyspeciesthroughvariousmechanisms,evolutionarybiologyisoneofthemostbasicandmostimportantproblems.Fundamentally,speciationisabasicmechanismofbiologicaldiversity.AlthoughDarwinhasbeenputforwardintheoriginofspecies,naturalselectionisadominantfactorofspeciation(Darwin,1859),butforalongtime,thespeciationprocessarecommonlybelievedtobecausedbyrandomprocess.Untiltheconceptofthereproductiveisolationisputforward,theroleofnaturalselectioninspeciationisonlytobetakenseriously,andthatspeciationisthereexistsimportantrelationshipwithgeographicalfactors.Inthispaper,thespeciationarediscussedindetail,andonthereproductiveisolationandspeciationmethodsaredetailedinthispaper.Keywords:Speciation;Reproductiveisolation;Geographyintoakindof;Thegeographyintoakindof.一、引言[1]物种，简称“种”，是生物分类学研究中的基本单元和核心，也是物种多样性研究的基础和前提。物种的形成和物种的概念及划分问题一样，是科学界一大难题。由于没有谁能完全经历自然界中物种的形成过程，所以，很多成种方式或者成种理论在很大程度上都是推测性的。因为仅仅是推测性的，所以各种模式理论层出不穷，如下文提到的地理成种、异域成种、同域成种、边域成种、隔离分化成种等等很多种模式和理论。这些模式理论都与当时的认识水平和认识角度有关，不好直接评价其优劣对错，不过这些理论模式的提出和进一步研究，可以加深人类对于物种形成这一问题的认识[2]。二、物种的概念我们先来简单讨论物种这一概念。物种是互交繁殖的自然群体，一个物种和其他物种在生殖上互相隔离。从这个定义我们可以看出，物种这一概念不仅仅是一个分类单位，也是一个客观存在（通过生殖隔离体现）物种这一概念也是随着历史不断变化的，这一变化也反映了生物分类学的历史发展[3]。在Linne创立生物分类学时期，物种被认为是上帝特定创造的，这种“神创物种”概念认为物种是不变的。Darwin的进化论确立后，进化物种概念产生，这个概念认为物种是一个独立的进化支系，有其独特的进化历史、进化特征、进化潜力和进化趋势。Huxley为带表的新系统学时期以后，生物学物种概念开始流行，这个概念认为，物种是个体间额可以交配和生殖繁衍(或潜在地具有这种能力)的一组自然种群,通过某种隔离机制,使得它们在遗传上同其它类似的一组种群相互隔离着。这种主要基于生物学特征确立的物种称为生物学物种。此外，还有有形态物种、表形物种等概念。这里不详述。三、生殖隔离区分物种的主要根据是有无生殖隔离。但我们也要看到，根据形态特征进行物种鉴定不但有效，而且方便，比如对于远古生物化石、以及无性繁殖的生物，生殖隔离就比较难以判据。生殖隔离是物种形成和保持相对稳定的生物学机制，在自然界中，它包括生态隔离、习性隔离、机械隔离和交配成功率降低4种基本类型。也可以说，存在着合子前障碍（繁殖期不同、生活环境不同、表现差异、配子隔离）和合子后障碍（杂种不活性、杂种不育性、杂种破落），这4种隔离方式是使现有物种保持遗传独立的重要生物学基础，同时由物种的定义可知，生殖隔离也与新的生物种的分化和形成有关。生殖隔离组阻止了不同生物种间基因的交流，促使各个隔离种群具有较强的遗传稳定性，而如果没有物种的相对稳定性，就没有生态系统的相对稳定性。在自然选择下，各个物种沿着与环境相适应的方向发展，形成了今日地球上丰富多彩的生物多样性[4]。（一）时间隔离有效地隔离了同地生物种，如美洲蟾蜍繁殖季节较早，弗氏蟾蜍的繁殖则较晚，繁殖时间的差异同一地的两种蟾蜍隔离开来。（二）行为习性上的隔离在动物中是最重要的隔离机制，动物的求偶动作、信号等往往十分专一，同一种地区相近的两种动物，由于求偶动作的不同，交配行为也能有效地被阻止，所以习性隔离也是十分有效的隔离机制。（三）机械隔离指不同种类的动物个体、大小差别很大（特别是生殖器官的结构差别很大）这一因素阻碍了亲缘关系较近的物种间的交配和授粉。有时，如植物，即使杂交发生了，杂交后代的花结构也是极端不协调的组合，不能共同发挥功能作用。（四）交配成功率的降低能有效地防止杂交，如果真的发生了杂交，杂种后代一般也将是不育的，如马和驴杂交而成的骡。尽管如此，物种之间的界限并非总是十分明确，这里我们提出亚种的概念，亚种间有明显的遗传差异，但没有生殖隔离。如大山雀、小山雀、南山雀亚种，这些亚种都可以看作是形成中的种。（五）物种分化可以划分为5个时期：物种分化静止期、I期(DNA出现多态性起始和慢速分化的准备期)、II期(DNA多态性迅速分化和趋异时期)、III期(物种平缓趋异和种化固定期)、IV期(物种分化完成期)。

图1:物种分化的五个时期四、物种形成的方式物种形成是指物种数量的增加，上文我们已经说到成种理论模式众多[5]。各种生物物种成种理论的出现，反映了科学家对这一问题的关注与重视。然而由于所处的研究领域不同，理论基础与出发点的不同，代表不同理论学派的专家之间的磋商、探讨甚至争议就在所难免。这类争议归纳起来表现在以下几个方面物种形成是渐变还是突变；地理成种和非地理成种的相对重要性；遗传物质与表型特征在物种形成中的作用；物种形成的模式是线系还是分支。生物界的各个门类变化很大,对于相应的类群来说,特定的成种理论可能更为适合。应清楚说明的是,关于物种形成的各种理论并不是相互排斥或对立的，只是强调物种形成的不同方面,它们之间很多是相互包容或互为印证的。为了更好地了解物种形成，下面以目前较为完善并被普遍接受的成种模式——地理成种模式为重点，从地理和非地理角度来剖析物种形成的机制。（一）地理成种指地理上更远的群体比临近的群体更能通过不育或者行为差异而形成生殖上的隔离。这是因为群体的亚种此时已经高度分化，远距离的群体如果相互接触，可能不发生杂交繁殖。真正与地理分隔因素关系很大的是异域成种。1、原因同一个种群在被分开时，存在着“建立者效应”，即两个被分开种群的基因频率，开始时往往是不完全相同甚至差别很大的。自然界中的突变是随机进行的，然而地点的不尽相同，造成环境对种群的不同选择方向和选择压力，使得不同地点群体的遗传结构，朝着适应环境条件的方向变化。[5]在自然选择的作用下，群体间的遗传差异累计到物种间的遗传差异，最终形成了两个不同