尼古丁上调NEAT1影响人牙周膜细胞炎性反应的研究

尼古丁上调NEAT1影响人牙周膜细胞炎性反应的研究牙周炎发生于连接牙体硬组织和牙槽骨的牙周膜中,是牙周支持组织中的一种严重影响口腔健康的疾病,其主要表现为牙周支持组织丧失。吸烟可使牙周炎发病率升高,加重牙周炎严重程度,同时降低牙周手术及非手术治疗效果。研究发现,烟草燃烧时产生的尼古丁可对人体多个组织和器官产生不良影响,其中包括牙周组织。课题组前期研究发现,尼古丁可作为配体,特异性的与人牙周膜细胞乙酰胆碱受体结合,参与牙周膜细胞炎性表达,但其具体机制仍不明了。越来越多的研究表明,lncRNA作为广泛存在于细胞内的非编码RNA,参与了细胞基因转录,炎性反应等方面的调控,然而关于lncRNA参与尼古丁引起牙周组织炎性反应的报道较少。由此作者推测:尼古丁与乙酰胆碱受体结合后,可通过影响lncRNA的表达进一步引起牙周组织炎性损伤。本研究旨在探寻lncRNA在吸烟相关性牙周炎致病机制中发挥的作用,为控制并治愈吸烟相关性牙周炎提供新思路。【目的】本实验拟通过探究尼古丁不同浓度和时间作用下人牙周膜细胞α7nAChR和lncRNANEAT1的表达,NEAT1的表达改变对细胞炎性因子表达的影响及可能作用机制,探索lncRNA在尼古丁介导的牙周炎致病机制中的作用。【方法】1、结合酶消化的改良组织块法培养人牙周膜细胞,并通过流式细胞实验对细胞来源进行鉴定。2、分别给予第5代人牙周膜细胞不同时间和浓度尼古丁作用,实时定量PCR检测细胞中NEAT1和α7nAChR表达情况,WesternBlot检测α7nAChR表达情况。确定尼古丁引起NEAT1和α7nAChR表达改变的最佳作用时间和浓度。之后给予α7nAChR激动剂尼古丁和/或其抑制剂α-BTX作用,实时定量PCR和原位杂交实验检测NEAT1的表达差异。3、给予第5代人牙周膜细胞尼古丁作用后,实时定量PCR检测IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表达并用ELISA验证。分别对细胞转染siRNA抑制NEAT1表达及对细胞转染质粒特异性扩增NEAT1表达后给予尼古丁作用,随后再次观察炎性因子表达改变,探索人牙周膜细胞在尼古丁作用后NEAT1和炎性相关细胞因子表达变化之间的关系。4、分别给予第5代人牙周膜细胞不同时间和浓度尼古丁作用,通过WesternBlot和免疫荧光检测NEAT1结合蛋白SFPQ和NONO的表达量及在细胞核内的分布情况。随后观察抑制SFPQ/NONO表达后尼古丁作用下人牙周膜细胞炎性相关细胞因子的表达。【结果】1、体外成功培养人牙周膜细胞。流式细胞检测结果显示,人牙周膜细胞表面,间充质细胞表面标志物CD105和CD90表达呈阳性,造血系统细胞表面标志CD14和血管内皮细胞表面标志CD31呈阴性。2、尼古丁可上调人牙周膜细胞NEAT1的表达,其最佳作用条件为10-5M尼古丁作用2h。尼古丁上调α7nAChR后,NEAT1表达上升,当抑制尼古丁与表达上调的α7nAChR结合后,NEAT1表达不变。3、尼古丁作用上调人牙周膜细胞NEAT1表达后,可特异性引起下游IL-8表达上升;抑制NEAT1表达后,IL-8表达随之下降;过表达NEAT1,IL-8表达随之上升。4、尼古丁作用人牙周膜细胞后,细胞核内蛋白SFPQ和NONO的表达量虽没有变化,但分布状态由弥散变为聚集。相比于单独尼古丁作用,抑制SFPQ后尼古丁作用可使IL-8表达进一步升高,而抑制NONO却没有相似变化。【结论】成功培养并鉴定人牙周膜细胞。尼古丁可通过α7