抗氧化三肽的定量构效关系及抗氧化作用分子机理研究

抗氧化三肽的定量构效关系及抗氧化作用分子机理研究自由基代谢失衡可诱发机体氧化应激损伤,导致多种疾病发生。抗氧化肽清除自由基的作用已得到广泛认同,作为一种新型安全的抗氧化剂,抗氧化肽在功能性食品、医药等领域显示出广阔的应用前景。但由于高活性抗氧化肽的序列特征、活性位点及抗氧化作用机理尚未完全弄清,难以指导高活性抗氧化肽的设计和筛选,阻碍了其大规模应用。本论文以抗氧化三肽为研究对象,揭示抗氧化三肽的定量构效关系（quantitativestructure-activityrelationship,QSAR）,用于预测抗氧化三肽的活性,继而指导高活性抗氧化三肽的设计,采用多种体外活性评价体系筛选高活性抗氧化三肽,并在两种细胞模型中阐明其抗氧化作用机理,为开发高活性抗氧化三肽奠定理论基础。本文的主要研究结果如下:（1）针对高活性抗氧化三肽序列特征不明确的问题,建立了2D-QSAR模型用于预测抗氧化三肽活性并指导高活性抗氧化三肽的设计。从文献中筛选91条抗氧化三肽,基于天然氨基酸的134种物理化学性质,用逐步回归（SWR）法筛选7种表征抗氧化三肽的结构参数,结合多元线性回归（MLR）、偏最小二乘法（PLS）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）算法建立了四种抗氧化三肽2D-QSAR模型。结果表明SWR-MLR、PLS、SWR-SVM、SWR-RF四种模型均具有良好的拟合能力和稳定性(²_（64）9)>0.8,²>0.7,²₀)>0.8),其中PLS模型的拟合能力最好(²_（64）9)=0.902),SWR-MLR模型稳定性最好(²=0.798,²_-17)（9）>0.792)。利用SWR-MLR模型的标准化系数预测了高活性抗氧化三肽各位点的有利氨基酸和不利氨基酸残基,结果显示C-端氨基酸为Pro、Tyr、Trp;N-端氨基酸为Cys、Tyr、Trp;2位氨基酸为Ile,Val,Lys,Leu是各位点的有利氨基酸残基。合成19种抗氧化三肽对各模型的预测能力进行验证,发现合成三肽的总抗氧化能力（ABTS法）实验值高于模型预测值,各位点有利氨基酸残基对抗氧化三肽总抗氧化活性（ABTS法）的贡献趋势与SWR-MLR模型标准化系数预测的趋势一致。（2）设计筛选高活性抗氧化三肽,进一步确定高活性抗氧化三肽结构特征。依据各位点优势氨基酸设计合成27条抗氧化三肽及18条去掉C-端或N-端的二肽,采用亚油酸氧化抑制、DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法进行体外活性评价。结果显示在亚油酸氧化抑制、ABTS、ORAC评价体系中YXY（X=Ile,Val,Lys）为高活性抗氧化三肽特征序列。在亚油酸氧化抑制评价体系中,YVY的活性最高,其亚油酸氧化抑制率与同浓度α-tocopherol相当;在ORAC、ABTS评价体系中YIY的活性最高,ORAC值为4.53±0.12μMTE/μM,与GSH（4.85±0.13μMTE/μM）相当;ABTS值为6.56±0.33μMTE/μM,高于GSH（1.86±0.24μMTE/μM）。DPPH体系中YXC（X=Ile,Val,Lys）为高活性抗氧化三肽特征序列,YKC的活性最高(IC₅₀=76.235μM)。FRAP评价体系中PXY（X=Ile,Val,Lys）为高活性抗氧化三肽特征序列,PVY(3.75±0.33Fe²⁺μM/μM)显示了最强的抗氧化活性。体外活性评价筛选出YIY、YVY、YKC、PVY四条高活性抗氧化三肽。（3）利用兔血红细胞氧化损伤模型进一步评价YIY、YVY、YKC、PVY的抗氧化活性。YIY、YVY、YKC、PVY均能有效抑制AAPH诱导的兔血红细胞溶血,浓度为2mg/mL的YIY、YVY、YKC、PVY使兔血红细胞氧化损伤溶血率分别下降61.19%,51.14%,31.96%,45.81%。四种抗氧化三肽通过抑制兔血红细胞脂质氧化、减少细胞内ROS生成、提高氧化损伤兔血红细胞中SOD、GSH-Px酶的活性,提高兔血红细胞中GSH/GSSG的比率,起到抗氧化作用,四种抗氧化三肽的保护作用呈现浓度依赖趋势。依据抗氧化三肽对兔血红细胞溶血抑制率,选择抗氧化活性强的YIY和YVY进行后续研究。（4）利用Caco-2细胞模型进一步研究了YIY、YVY的抗氧化活性及其抗氧化作用的分子机理。采用细胞形态观察、试剂盒检测、流式细胞检测技术、Real-timePCR和蛋白质免疫印迹技术,探究了YIY、YVY对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用及其分子机理。发现浓度0.5³mg/mL的YIY、YVY对Caco-2细胞无明显毒性。YIY、YVY能显著抑制氧化损伤Caco-2细胞活力下降,减少细胞中MDA的生成及LDH的泄漏,保护作用表现浓度依赖趋势。YIY、YVY对氧化损伤Caco-2细胞中CAT、GSH-Px、SOD、GR酶活性下降有显著抑制作用,能提高细胞中GSH/GSSG比率,恢复细胞氧化还原平衡。3mg/mLYIY、YVY可抑制氧化损伤Caco-2细胞中Caspase-3的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达,抑制促凋亡蛋白Bax蛋白的表达。YIY、YVY预孵育可上调氧化损伤Caco-2细胞中Keap1-Nrf2-ARE信号通路调控的下游抗氧化相关基因Ho-1,Nqo1和Gstm1的表达,促进HO-1、NQO1和GSTM1蛋白的表达。本论文结合生物信息学中QSAR理论建立了抗氧化三肽活性预测模型,基于SWR-MLR模型设计并筛选了YIY、YVY、YKC、