谷实夜蛾肠道微生物介导番茄植株防御反应及其机理的研究

谷实夜蛾肠道微生物介导番茄植株防御反应及其机理的研究昆虫肠道内栖息着大批微生物,这些微生物携带着与宿主昆虫相关的遗传信息,并能够影响昆虫的行为和生理状况。尽管已有部分研究发现昆虫肠道共生微生物能够介导植物的防御反应,但这些研究的主要对象集中在甲虫或者一些刺吸式昆虫上,而对鳞翅目昆虫肠道共生微生物调控植物防御反应的研究截至到目前仍然比较缺乏。本研究首先利用16SrRNA测序和MALDI-TOF质谱法等方法鉴定从野外玉米地采集的谷实夜蛾（Helicoverpazea）（鳞翅目夜蛾科）肠道回流液中分离得到肠道相关的细菌微生物。分别通过对番茄植株和室内饲养的谷实夜蛾进行细菌的接种侵染,检测被侵染后番茄植株中多酚氧化酶（Polyphenoloxidase,PPO）活性和被侵染后室内饲养的谷实夜蛾幼虫唾液腺中葡萄糖氧化酶（Glucoaseoxidase,GOX）活性,从而找到对两者均有作用效果的细菌菌株。通过酶活性检测、生物测定、荧光定量PCR、激光共聚焦显微镜观测、SDS、Westernblot蛋白质杂交等方法,研究被路德维希肠杆菌（Enterobacterludwigii,E.ludwigii）接种侵染后的谷实夜蛾对番茄植株中防御信号所调控的基因表达,相关防御酶活性以及植物激素含量的影响。然后,利用SDS和Westernblot研究了E.ludwigii接种侵染对谷实夜蛾在番茄叶片上分泌GOX的影响。最后,通过激光共聚焦显微镜研究了E.ludwigii接种侵染对谷实夜蛾在番茄叶片上分泌肠道回流液的影响,并利用所设计的E.ludwigii特异性引物检测E.ludwigii是否可以通过谷实夜蛾肠道回流液等方式与番茄叶片接触。本研究从生理生化和分子水平上证实谷实夜蛾肠道相关细菌主要通过影响其宿主昆虫唾液中葡萄糖氧化酶等成分来间接影响番茄植株抗虫诱导防御反应,研究的主要内容和结果如下:1.来源于田间和实验室的谷实夜蛾肠道相关细菌分离与鉴定采用传统的细菌培养法分别培养了从田间采集和实验室饲养的谷实夜蛾幼虫中收集肠道回流液,首先发现野外采集的谷实夜蛾单位体积肠道回流液中的细菌群落总数明显多于室内饲养的谷实夜蛾单位体积肠道回流液中的细菌群落总数。然后再结合16SrRNA测序和biotyper等鉴定方法,16种从田间采集的谷实夜蛾中分离到菌株被送去测序和鉴定,得到14种不同种菌株。其中属于Enterobacter有5种菌种,有4种菌株属于Pantoea,属于Rahnella有2种,剩下的菌株分别属于Erwinia、Klebsiella、Raoultella和Serratia。然而,从室内饲养的谷实夜蛾肠道回流液中选择的8个菌种被送去测序和鉴定,发现这8个菌种均属于Enterococcus,并且这些菌株序列高度相似。2.谷实夜蛾肠道相关细菌的筛选首先发现从田间采集的谷实夜蛾幼虫唾液腺中GOX活性显著高于室内饲养的谷实夜蛾唾液腺中GOX活性。为了进一步验证是否唾液腺体中GOX活性与肠道细菌的功能,将从田间采集的谷实夜蛾分离得到的肠道相关微生物重新接种到室内饲养的谷实夜蛾幼虫,发现14种菌株中有4种可以提高幼虫唾液腺体中GOX活性,它们分别为3-1,（Rahnellaaquatilis）、2b（E.ludwigii）、5-1（Enterobactersp.）和6-1（Pantoeaagglomerans）。同样地,将分离得到的14种细菌分别接种到预先受到机械损伤处理的番茄叶片上,发现其中有三种菌株可以诱导番茄叶片中PPO活性,这些菌株分别是3-1（Rahnellaaquatilis）、2b（E.ludwigii）和5-1（Enterobactersp.）。3.E.ludwigii接种谷实夜蛾对番茄植株诱导防御反应的影响接种了E.ludwigii的谷实夜蛾幼虫取食番茄叶片后48h,可以明显诱导番茄叶片中PPO活性。同时,茉莉酸信号途径调控与抗虫相关的防御基因Pin2,CysPI和PPOF在受到预先被E.ludwigii接种侵染的幼虫取食危害24h后的番茄叶片中的表达量明显上升,而水杨酸信号途径调控的与病程相关蛋白Pr1a（P4）的表达量明显被抑制。当让初孵的谷实夜蛾幼虫取食预先被E.ludwigii接种侵染的谷实夜蛾幼虫为害过的番茄叶片,5天后称量幼虫的体重,发现幼虫的体重增长明显被抑制。4.E.ludwigii接种番茄植株对其防御反应的影响当番茄植株被不同浓度的E.ludwigii直接接种侵染48h后,发现只有在浓度达到10⁹CFU/ml(OD₆₀₀=0.1)时,E.ludwigii才能够显著抑制番茄叶片中PPO活性。同时,番茄叶片在受细菌接种侵染24h后,番茄叶片中茉莉酸信号途径调控与抗虫相关的防御基因Pin2的表达量明显被抑制,而水杨酸信号途径调控的与病程相关蛋白Pr1a（P4）的表达量明显上升。5.E.ludwigii接种对谷实夜蛾在番茄叶片上分泌GOX的影响通过对被E.ludwigii接种谷实夜蛾取食过的番茄叶片部位进行洗脱,可以收集到幼虫分泌在番茄叶片受伤部位上的蛋白质。利用GOX特定的抗体和Westernblot蛋白质杂交技术,从受到不同虫害处理的番茄叶片上洗脱下来的蛋白质样品中检测目的蛋白GOX的存在以及含量。实验结果显示,未接种细菌E.ludwigii的谷实夜蛾幼虫在番茄叶片上大约分泌GOX量明显少于接种了E.ludwigii谷实夜蛾幼虫在番茄叶片上分泌GOX的量。6.E.ludwigii接种谷实夜蛾唾液及GOX对番茄植株诱导防御反应的影响通过人工收集幼虫所分泌的唾液,将收集于E.ludwigii接种谷实夜蛾的唾液用来处理预先受到机械损伤的番茄叶片,发现与用收集于未被细菌接种侵染谷实夜蛾的唾液处理相比,番茄叶片中PPO活性被明显诱导。同时,通过解剖的方法获得谷实夜蛾幼虫唾液腺体,然后将收集于E.ludwigii接种谷实夜蛾的唾液腺体匀浆并用来处理预先受到机械损伤处理的番茄叶片,发现番茄叶片中PPO活性被明显上升。此外,利用商品化的GOX直接处理预先受到机械损伤处理的番茄叶片,发现GOX浓度越高,其对番茄叶片中PPO活性诱导作用越强。7.E.ludwigii接种谷实夜蛾对其在番茄植株上分泌肠道回流液的影响尽管已有研究证明谷实夜蛾并不会在番茄植株上分泌可测含量的肠道回流液,但是E.ludwigii接种是否可以影响谷实夜蛾在番茄叶片上分泌肠道回流物尚不清楚。采用喂食含有荧光染料的人工饲料方法对预先被buffer和E.ludwigii接种的谷实夜蛾进行处理,结合激光共聚焦显微镜对肠道回流液以及被幼虫所取食的番茄叶片受伤部位的观察,发现E.ludwigii接种并不能改变谷实夜蛾不能在番茄植株上分泌可测含量的肠道回流物这一现象和结果。8.特异性引物检测在被谷实夜蛾取食过的番茄叶片上E.ludwigii的存在特异性引物的设计主要是利用通用引物GS4和EC5来扩增E.ludwigii的16S和23S之间的片断（Intergenictranscribedspacer,ITS）,根据所扩增得到的序列设计一条正义链ENTI