几丁质酶OfChtⅡ和O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶hOGA的晶体结构及活性抑制

几丁质酶OfChtⅡ和O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶hOGA的晶体结构及活性抑制糖苷水解酶(glycosidehydrolases,GH)是一类负责催化含糖化合物中糖苷键断裂的酶,在自然界中广泛存在。GH18家族几丁质酶和GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是其中重要的两类,它们都采用了底物辅助保留催化机理。GH18家族几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、线虫、植物、节肢动物和哺乳动物体内,主要负责水解环境中或生物体自身的几丁质,在细胞营养、病原入侵、胚胎发育、昆虫蜕皮和免疫防御等多种生命活动中都发挥了重要的作用。对昆虫而言,几丁质是其外骨骼、气管和中肠围食膜的重要结构组分,因此几丁质酶对于昆虫的生长发育至关重要。在昆虫众多的几丁质酶中,II分支几丁质酶(ChtII)是其中结构域数目最多、分子量最大的一种。鳞翅目昆虫中,ChtII与I分支几丁质酶(ChtI)和几丁质酶h(Chi-h)共同参与蜕皮过程中表皮几丁质的水解,虽然ChtI和Chi-h的结构和功能已经得到了很好的研究,但ChtII的结构仍不清楚。目前ChtII的研究集中在基因水平,通过RNA干扰使ChtII基因表达下调会导致昆虫蜕皮障碍并死亡,因此ChtII可以作为一个潜在的杀虫剂靶标,而ChtII抑制剂的研究也有助于新型农药的开发。GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是生物体内负责水解O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)翻译后修饰的糖苷水解酶,对于维持细胞内正常的O-GlcNAc水平至关重要。O-GlcNAc是真核生物中一种重要的动态翻译后修饰,参与细胞内包括信号转导、基因转录翻译和细胞循环在内的多种重要生理过程,O-GlcNAc水平的失调与多种疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶不仅能通过调控O-GlcNAc水平直接影响相关的生理过程,而且能通过O-GlcNAc与磷酸化修饰的相互作用间接影响更多的信号通路。因此,O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶的抑制剂在研究和治疗O-GlcNAc失调引发的相关疾病方面具有潜在的应用价值。本论文以农业害虫亚洲玉米螟来源的GH18家族几丁质酶(OfChtⅡ)和人来源的GH84家族的O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(hOGA)作为研究对象,主要获得以下结果:(1)获得了OfChtⅡ的基因和蛋白序列根据不同昆虫ChtⅡ的保守序列设计引物,经过同源序列获取从亚洲玉米螟成虫的cDNA中克隆获得了OfChtⅡ的基因序列9077bp,GenBank登录号为MF034108.1。其中编码区为157-8943位核苷酸,编码2929个氨基酸,GenBank登录号为AS066823.1。序列分析发现OfChtⅡ有5个属于GH18家族的特征结构域以及7个几丁质结合结构域。5个GH18家族特征结构域中有三个结构域的催化残基发生突变,只有靠近C端的第二和第三个GH18结构域有催化活性。(2)OfChtⅡ截短体的水解活性和结构特征全长的OfChtⅡ不稳定且难以在体外重组表达,因此我们重组表达了四个截短体:OfChtⅡ-C1,OfChtⅡ-C2,OfChtⅡ-C1C2和OfChtⅡ-B4C1。水解活性实验发现,OfChtⅡ截短体对小分子底物的水解活性低,而对高聚底物的活性随着结构域数目的增加而升高,说明OfChtⅡ全长在水解高聚底物时具有很大的潜力。通过悬滴蒸汽扩散法获得了OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2蛋白及蛋白-底物的晶体结构,二者的蛋白结构具有很高的结构相似性,都具有一个(β/α)8TIM桶组成的核心结构域和一个几丁质插入结构域。OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2的表面都存在着一条芳香族残基组成的长且深的底物结合裂缝,兼具OfChtⅠ和OfChi-h底物结合裂缝的结构特征。但是,OfChtⅡ的活性口袋外部缺乏有利于晶态几丁质结合的结构元件,不过它的多个几丁质结合域可能会弥补这个缺陷。(3)OfChtⅡ小分子抑制剂的筛选和抑制机理研究筛选获得了OfChtⅡ的多个小分子抑制剂,通过复合物晶体对部分抑制剂的抑制机理进行了研究。其中壳八糖(G1cN)8占据了底物结合裂缝的-3到+5位点,主要通过糖环与芳香族残基的疏水堆积作用结合;联吡啶并嘧啶类化合物2-8-S2结合在底物结合裂缝的+1和+2位之间,两个2-8-S2分子通过π-π堆积与两个保守的色氨酸形成一种双侧夹心结构。(4)hOGA的小分子抑制剂设计和抑制机理研究设计合成了一系列具有新型骨架结构的hOGA小分子抑制剂,包括NAG-噻唑啉的2-位衍生物,甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物和硫苷-萘酰亚胺杂合物分子。测定了化合物对GH20家族和GH84家族糖苷水解酶的活性和选择性,通过结构生物学和分子对接