尼古丁通过激活大麻素受体减轻Aβ1-42所致神经损伤的实验研究

尼古丁通过激活大麻素受体减轻Aβ1-42所致神经损伤的实验研究阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要表现为进行性的学习和认知功能减退。研究表明,AD发生认知功能减退的重要原因之一是脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)对神经细胞的毒性作用,过量的Aβ可损伤神经元和激活小胶质细胞。因此,降低Aβ的神经毒性是防治AD的主要方法之一。一些流行病学研究显示,吸烟人群AD发病率明显低于非吸烟人群,提示烟草中的主要成分尼古丁可能具有抗Aβ所致的神经损伤作用,但其作用机制尚未完全阐明。大量文献证明,激活脑内大麻素(cannabinoid,CB)系统具有神经保护作用。大麻素CB1受体激活后可保护神经元,大麻素CB2受体激活可抑制小胶质细胞过度活化。此外,饶有兴味的是,大麻素受体拮抗剂可用于治疗尼古丁成瘾,天然大麻素四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)也可减轻尼古丁戒断症状。上述证据提示,尼古丁的部分生物学效应可能通过大麻素受体介导。本实验我们将神经元细胞系HT22细胞暴露于Aβ1-42,建立Aβ神经元损伤模型,观察尼古丁对HT22细胞的保护作用;采用Aβ1-42刺激小胶质细胞系N9细胞,建立Aβ小胶质细胞激活模型,观察尼古丁抑制N9细胞过度活化的作用;并对大麻素受体和PKC(proteinkinaseC,PKC)在其中的作用进行探索。我们在实验中发现,CB1受体介导了尼古丁保护HT22细胞抗Aβ1-42损伤;CB2受体介导了尼古丁抑制Aβ1-42引起的N9细胞激活;尼古丁通过大麻素受体产生的神经保护作用需要PKC的参与。由于烟草戒断研究中发现小剂量尼古丁制剂(如电子香烟、尼古丁贴片)具有低毒性、低成瘾性等优点,本研究的结果将为探明尼古丁的神经保护作用机制和拓宽尼古丁的可能临床适应症提供实验证据,也为AD的治疗方法提供了新思路。第一部分大麻素CB1受体介导尼古丁保护神经元的研究实验一尼古丁对神经元的保护作用观察目的:Aβ神经元损伤模型的建立和尼古丁(nicotine,Nico)最佳保护浓度的确定。方法:将HT22细胞分为对照组和1、5、10μM的Aβ1-42损伤组,孵育24h后,用噻唑蓝(thiazolylbluetetrazoliumbromide,MTT)方法以检测细胞活力。随后,将HT22细胞分为6组,分别为对照组、5μM的Aβ1-42损伤组和不同浓度(1、10、100和500μM)的尼古丁保护组,孵育24h后,MTT法检测细胞活力。结果:5μM的Aβ1-42损伤24h,可降低HT22细胞活力至对照组的60%左右,选择5μM作为Aβ1-42的损伤浓度进行随后实验。100μM的尼古丁,可显著恢复细胞活力,选择100μM的尼古丁进行随后机制研究。结论:我们选择5μMAβ1-42建立神经元损伤模型,使用100μM尼古丁研究其保护机制。实验二CB1受体介导尼古丁对神经元的保护作用目的:观察大麻素CB1受体在尼古丁保护HT22细胞中的作用。方法:将HT22细胞分为5组,分别为空白对照组(Control)、Aβ损伤组、Nico保护组、CB1拮抗剂AM251干预组和AM251对照组。孵育24h,MTT法检测细胞活力、比色法检测培养基内乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)含量、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Westernblot观测CB1蛋白和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax表达。结果:与Aβ损伤组比较,Nico保护组细胞活力增加(P<0.05),LDH释放减少(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),CB1和Bcl2表达上调(P<0.05),Bax表达下调(P<0.05)。CB1拮抗剂AM251显著逆转了尼古丁的上述作用(P<0.05)。结论:CB1受体介导了尼古丁对HT22细胞的保护作用。实验三PKC在尼古丁保护神经元中的作用目的:观察PKC在尼古丁保护HT22细胞中的作用。方法:将HT22细胞分为5组,分别为空白对照组(Control)、Aβ损伤组、Nico保护组、CB1拮抗剂AM251干预组和AM251对照组。采用Westernblot测定细胞膜上和细胞质内PKC蛋白表达,计算二者比值,检测PKC激活程度。随后,将HT22细胞分为5组,分别为空白对照组、Aβ损伤组、Nico保护组、PKC抑制剂白屈菜红碱(chelerythrine,Che)干预组和Che对照组。处理24h,采用相差显微镜观察细胞形态,MTT法测定细胞活力,并检测LDH释放量。结果:与Aβ损伤组相比,Nico保护组PKC激活水平显著升高(P<0.05);CB1拮抗剂AM251逆转了尼古丁的上述作用(P<0.05)。与Aβ损伤组相比,Nico保护组细胞形态改善,细胞活力增加,LDH释放减少(P<0.05);PKC抑制剂Che逆转了尼古丁的上述作用(P<0.05)。结论:PKC作为CB1受体信号下游介导了尼古丁对HT22细胞的保护作用。第二部分大麻素CB2受体介导尼古丁抑制小胶质细胞活化的研究实验一尼古丁抑制小胶质细胞激活作用观察目的:建立Aβ小胶质细胞激活模型和确定尼古丁最佳作用浓度。方法:将N9小胶质细胞分为对照组(Control)和1、2.5、5、10μM的Aβ1-42刺激组。处理24h,采用Westernblot检测细胞诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)蛋白表达水平。随后,将N9小胶质细胞分为6组,分别为对照组、5μM的Aβ1-42刺激组和不同浓度(1、10、100、500μM)的尼古丁处理组,24h后,ELISA法检测培养基内TNF-α和IL-6含量。结果:5μM的Aβ1-42显著上调N9细胞iNOS蛋白表达(P<0.05)。100μM的Nico显著降低N9细胞TNF-α和IL-6释放量(P<0.05)。结论:我们选择5μMAβ1-42建立小胶质细胞激活模型,使用100μM尼古丁研究其抑制N9细胞活化的机制。实验二尼古丁减轻小胶质细胞激活的机制研究目的:探讨尼古丁减轻N9小胶质细胞活化的机制。方法:将N9细胞分为5组,分别为空白对照组(Control)、Aβ损伤组、Nico处理组、CB2拮抗剂AM630干预组和AM630对照组,孵育24h,采用Westernblot、免疫细胞化学法检测CB2、iNOS、精氨酸酶-1(arginase1,Arg-1)蛋白表达;采用ELISA法测量培养基内TNF-α、IL-6、IL-10和脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)的浓度。随后,将N9小胶质细胞分为Control组、Aβ损伤组、Nico处理组、PKC抑制剂Che干预组和Che对照组,孵育24h,检测培养基内TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF浓度。结果:与Aβ损伤组比较,Nico处理组细胞iNOS表达下调(P<0.05),Arg-1表达上调(P