第八章 吸光光度法教材

第八章吸光光度法Spectrophotometry2024/3/24第一节概述一、吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。吸光光度法的分类（1）根据所用仪器的不同：目视比色法、光电比色法和分光光度法。（2）根据所吸收的波长范围不同：紫外分光光度法(波长200～400nm),可见分光光度法(400～750nm)红外光谱法(750～2500nm)2024/3/24吸光光度法特点：（1）灵敏度高：10-5~10-6，10-7~10-8，10-10

mol·L-1（2）准确度高：比色分析，相对误差5~10%，分光光度法，2~5%，1~2%；（3）应用广泛：可测定绝大多数无机物和许多有机物；（4）操作简便仪器设备易普及。2024/3/24二、光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二像性。λν=c，E=hν=hc/λ单色光：复合光：由单一波长的光组成的光由不同波长的光组成的光Planck常数：h=6.626×10-34

J×S光的波长越短（频率越高），其能量越大。白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光2024/3/24三、物质对光的选择性吸收1、吸收光谱的产生：吸收光谱原子吸收光谱：原子外层电子选择性吸收某些波长电磁波线光谱分子吸收光谱：带光谱由价电子跃迁产生的光谱，也称紫外—可见光谱电子光谱振动—转动光谱由分子振动或转动能级跃迁引起的，也称红外光谱2024/3/24分子能量电子能振动能转动能分子振动能级：分子内部价电子运动，分子内原子振动和分子绕其重心的转动。2024/3/24分子吸收光谱产生：分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级跃迁，从基态跃迁到激发态2024/3/24电子跃迁能级较大，能量在1~20eV，紫外可见吸收光谱在200~780nm2024/3/24物质的颜色:

物质的颜色由透过光决定。由于不同的物质结构不同具有不同量子化能级，产生的吸收不同。其颜色和光的吸收、透过、反射有关。2024/3/24①互补色光：把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合，成为白光，称为互补色光。2024/3/24②无色：对光谱中各种色光透过程度相同。③有色：物质的颜色由它透过或反射的光决定。④黑色:几乎吸收所有的入射光。⑤白色:几乎全部反射入射光。2024/3/24吸收曲线：测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度(即吸光度A)，以波长(λ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得到的一条吸收光谱曲线。（1）吸收曲线用途：①进行定性分析；②进行定量分析；③选择吸收波长；④判断干扰情况。2024/3/24第二节光的吸收定律一、朗伯-比尔定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系入射光I0透射光ItT称为透光率TransmittanceT取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%A：吸光度b：光程的长度(cm):比色皿的厚度c：溶质的浓度K：比例常数，与物质的性质、入射光波长等有关，与浓度无关。2024/3/24c：mol/L摩尔吸光系数L·mol–1·cm-1MolarAbsorptivityc：g/L吸光系数AbsorptivityL·g–1·cm-1与a的关系：2024/3/24

的含义（１）

是吸光物质在一定波长和溶剂中的特征常数，反映该吸光物质的灵敏度．

值越大，表示该吸光物质对此波长光的吸收能力越强，显色反应越灵敏，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以

max表示；（２）根据朗伯－比耳定律，

＝A/bc

由实验结果计算，以总浓度代替吸光物质的浓度，

为表观摩尔吸收系数，

=Ma,M是摩尔质量；2024/3/24

吸光度的加和性若溶液中含有两种或两种以上的吸光物质，且各物间无相互作用，则测得的吸光度为各种吸光物质吸光度之和。

如溶液中含有A、B两物质，对波长为λ的光均有吸收，则A=AA+AB2024/3/24

例题铁（Ⅱ）浓度为5.0×10-4

g·L-1

的溶液，与1，10-邻二氮菲反应，生成橙红色络合物。该络合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19。计算1，10-邻二氮菲铁的a及

。解：已知M(Fe)=55.852024/3/24分光光度法定量分析常要绘制标准曲线，即固定液层的厚度及入射光的波长和强度，测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度，以吸光度对标准溶液的浓度作图（一过原点的直线），得到标准曲线。在相同条件下测定试样的吸光度，从工作曲线查得试样浓度，这就是工作曲线法。但在实际工作中，特别是浓度较大时，常会出现标准曲线不为直线的现象，这称为偏离朗伯比尔定律。二.偏离朗伯-比尔定律的原因偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：光学因素；化学因素2024/3/24二.偏离朗伯-比尔定律的原因1、光学因素：非单色光引起的偏离严格地说，朗伯-比尔定律只适用于单色光。设入射光由

1

和2

两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律对1：对2：2024/3/24

1+2

：若：或或2024/3/24非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，b和c固定，

反映了

随波长变化的情况，单一波长，

固定；不同波长，

不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。2024/3/242.化学因素：由溶液本身的化学和物理因素引起的偏离(1)由于介质不均匀性引起的偏离当被测试液是胶体、乳浊液或悬浮物时，将对入射光产生散射现象，导致吸光度增大，而引起正偏离(偏向吸光度轴)。

2024/3/24橙色(2)由于溶液中的化学反应引起的偏离如吸光物质的离解、缔合、形成新化合物或互变异构等。Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO42-黄色2024/3/24第三节目视比色法及光度计的基本部件一、目视比色法用眼睛比较溶液颜色深浅以测定物质含量的方法。测定方法：标准系列法。标1标2标3标4标5未知2024/3/24标准系列未知样品2024/3/243、优点：设备简单，操作方便，不要求严格遵守比尔定律。4、用途:用在要求不高的常规分析中。5、缺点：准确度不高，标准系列制作麻烦，容易受干扰。2024/3/24二、分光光度法及光度计1、分光光度法：使用分光光度计进行测定的方法。2、与比色法比较：（1）是用仪器代替人眼进行测量，消除了人的主观误差，提高了准确度；（2）待测溶液中有其它有色物质共存时，可以选择适当的单色光和参比溶液来消除干扰，因而提高选择性；（3）在分析大批试样时，使用标准曲线法可以简化手续，加快分析速度。2024/3/24分光光度计Agilent6010紫外/可见分光光度计2024/3/242024/3/243、光度计组成：2024/3/243、光度计组成：光源—单色器—吸收池—检测系统(1)光源：要求稳定，强度高.常用6~12V钨丝灯或卤钨灯，2600~2870K,发320nm~2500nm的连续光谱可见光部分用其360~800nm紫外光：氢灯，氘灯，185~350nm；2024/3/24(2)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置，分为棱镜和光栅两种。光栅的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。2024/3/24也称吸收池，长方体，两面透明，有玻璃和石英玻璃两种，规格有0.5，1.0，2.0，5.0cm等；（3）吸收池：比色皿：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区

2024/3/24（4）检测器：检测器的作用是接受从吸收池发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电池、光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。2024/3/24显示装置：检流计，数显，记录仪，CRT。2024/3/24练习题1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围是A.400~780nmB.200~320nmC.200~780nmD.200~1000nmA2、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大时，最大吸收波长和吸光度分别是A.不变，增加B.不变，减少C.增加，不变D.减少，不变A2024/3/243、下列表述不正确的是A.吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系B.吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长C.吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标D.吸收光谱曲线，表明了吸光物质的吸收特性C2024/3/244、影响有色物质摩尔吸收系数的因素是A.吸收池厚度B.入射光波长C.有色物质溶液的浓度D.入射光的强度B2024/3/245、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，用1.00cm比色皿测得其透光度为T，，当浓度减小为0.50c时，，在同样条件下测定，其透光率应为A.T2B.2TC.T1/2D.T/2C2024/3/246、在光度计的检流计上刻有A和T，二者关系为7、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，吸光度A=0.30，那么当浓度为2c时，该溶液的吸光度A=0.602024/3/24第四节显色反应及显色条件的选择显色反应：将待测组分转变为有色化合物的反应。显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂。光度分析中，对于本身无吸收的待测组分，先要通过显色反应将待测组分转变成有色化合物，然后测定吸光度或吸收曲线。在光度分析中选择合适的显色反应，并严格控制反应条件，是十分重要的。2024/3/24一、显色反应的选择1、显色反应的类型配位反应和氧化还原反应。2、对显色反应的要求：（1）选择性好，干扰少，或干扰容易消除；（2）灵敏度足够高:超高灵敏高灵敏中等不灵敏2024/3/24（3）有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。对于形成不同络合比的络合反应，必须注意控制实验条件，使形成一定组成的络合物，以免引起误差。（4）有色化合物的化学性质应足够稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度变化小。这就要求有色化合物不受外界环境条件的影响：如日光照射、空气中的氧核CO2；此外也不受溶液中其他化学因素的影响。2024/3/24（5）有色化合物与显色剂之间的颜色差别大。显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。对比度：两有色物质最大吸收波长之差2024/3/24二、显色条件的选择1、显色剂的用量：待测组分显色剂有色配合物2024/3/242、溶液的酸度⑴影响显色剂浓度和颜色；显色剂不少是有机弱酸，因此酸度的变化，将影响显色剂的平衡浓度，并影响显色反应的完全程度。⑵影响Mn+的存在状态;2024/3/24⑶影响配合物的组成2024/3/243、显色温度的选择一般在室温，有时需加热，通过实验确定2024/3/244、显色反应时间制作吸光度-时间曲线5、溶剂：降低有色化合物离解度，增加灵敏度如在Fe(SCN)3的溶液中加入与水混溶的有机试剂（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解离度而使颜色加深，提高了测定灵敏度。2024/3/246、干扰及其消除：（1）控制溶液酸度（2）加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂（3）利用氧化还原反应改变离子的状态（4）选择适当的波长，要求吸收大，干扰小（5）选择合适的参比溶液（6）采用适当的预先分离的方法2024/3/24三、显色剂1、无机显色剂应用不多，因其生成络合物不稳定，灵敏度选择性也不高。目前有使用价值的主要有：硫氰酸盐：测定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb5+等。钼酸铵：测定P、Si、W等。过氧化氢：测定V5+、Ti4+等2024/3/242、有机显色剂：⑴特点：有机显色剂大多能与金属离子生成极其稳定的螯合物，具有特征颜色，其选择性，灵敏度均高。不少螯合物易溶于有机溶剂，可以进行萃取比色。有机显色剂多是含有生色团和助色团的化合物2024/3/24⑵生色团：含有不饱和键的基团，如-N=N-,＞C=C＜,-N=O,＞C=O,＞C=S、醌基等。⑶助色团：某些含有孤对电子的基团如-OH,-RH,-NH2,-NHR,-SH,-Cl－,-Br－,-I－等。它们与生色团上的不饱和键相互作用,影响其吸收,使颜色加深（红移）。2024/3/24⑷类型：①偶氮类：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等②三苯甲烷类：铬天青S，二甲酚橙，结晶紫等③其它型：OO,NN,含S型等2024/3/242024/3/24第五节吸光度测量条件的选择一、入射光波长的选择1、原则：“吸收最大，干扰最小”，

大，A变化小的区域。选520nm进行测定2024/3/24二、参比溶液的选择1、蒸馏水：试液、显色剂均无色时，用蒸馏水作参比；2、试剂空白：显色剂有色时，用不加试样溶液的试剂空白作参比；3、试液空白：试液中有其它有色离子时，用不加显色剂的被测液作参比；2024/3/24三、吸光度读数范围的选择（1）（2）2024/3/24以有限值表示：一般光度计ΔT约为±0.2%~±2%。假定ΔT为0.5%，上式导数为零求出当T=0.368(A=0.434)时,Et最小(1.36%)。2024/3/242024/3/24A=0.15~1.0或T=70%~10%的范围内，浓度测量的相对误差较小。2024/3/24四、标准曲线的制作1、制作依据吸光度与吸光物质的含量呈正比关系2024/3/242、制作方法：在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列（不少于5）不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（或工作曲线）。再测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。2024/3/243、标准曲线不通过原点原因参比选择不当；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清洁等。2024/3/242024/3/24练习题1、以M表示被测物质的摩尔质量，则摩尔吸收系数

与吸光系数a之间的关