第二章 生物大分子教材

生物大分子（biopolymer、biomacromolecule)

是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。包括核酸、蛋白质脂类、多糖以及复杂大分子。

自然界典型的生物大分子的分子量在10～103ＫＤ之间。转录翻译复制基因表达调控核酸种类分布性质结构功能遗传信息传递、表达核酸概况基因突变与重组研究方法第二章生物大分子第一节DNA与染色体第二节基因组的结构与功能第三节DNA的复制第四节DNA的损伤、修复第五节DNA的转座第六节RNA核酸（nucleicacid）

是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子。依据其化学组成,天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonuleicacidRNA)。第一节

核酸概况

一

核酸的化学组成

核酸核糖脱氧核糖核苷酸磷酸核苷戊糖碱基AGTCU核酸的化学组成1.1

元素组成C、H、O、N、P（9~10%）1.2

分子组成——碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱——戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖——磷酸(phosphate)核酸单核苷酸磷酸碱基戊糖核苷核酸的化学组成嘌呤(purine)

腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)1.2.1碱基

嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)1.2.2戊糖DNA中戊糖的为β-D-2-脱氧核糖(deoxyribose)RNA中的戊糖的为β-D-核糖(ribose)

β-D-2-脱氧核糖β-D-核糖1.2.3核苷（nucleoside）核苷戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)核苷（nucleoside）碱基戊糖糖苷键purine：N9-C1’pyrimidine：N1-C1’HHHHHHHHH核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。1.2.4核苷酸（nucleotide）碱基、戊糖、核苷、核苷酸的关系

NitrogenousbasePentosesugarHOCH2HOHDoxyribose(inDNA)HOCH2HOOHRibose(inRNA)PhosphatePyrimidinesCytosineThymineUracilCUTPurihesAdenineGuanineAG核酸磷酸核苷戊糖碱基

3.核酸是遗传物质遗传物质必须具备以下特点:①必须稳定地含有关于有机体细胞结构、功能、发育和繁殖的各种信息。②必须能精确地复制，这样后代细胞才能具有和亲代细胞相同的信息。③必须能够变异，如果没有变异，生物就不能改变、适应，进化也不能发生。orand可分离遗传物质的发现(1)1952年,Hershey的噬菌体感染实验DNA是遗传物质遗传物质的发现(2)遗传物质的发现(3)1956年AGierer和GSchraman发现从烟草花叶病毒分离的RNA也能侵染植物,产生典型的烟草花叶病毒所致的病斑,如用RNA酶处理,则RNA就失去感染的能力,而分离的蛋白部分没有这种感染力。这个实验的结果证明了烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，而不是蛋白质。二核酸的一级结构

单核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接成大分子——多核苷酸。5’-末端：P3’-末端：OH

DNA和RNA的一级结构是指核苷酸的数量和排列顺序。

核苷单核苷酸3′5′磷酸二酯键5´3´糖苷键酯键AGP5

P

TPGPCPTPOH3

书写方法5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

2.2

DNA的二级结构定义：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。分类：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA

2.2.1DNA螺旋的几种构象及其动态平衡

（一）Watson–Crick右手双螺旋结构（B-DNA构象）相对湿度为92%时，DNA钠盐纤维为B-DNA构象。在天然情况下，绝大多数DNA以B构象存在。

1，主链:

2，碱基对

3，螺距

4，大沟和小沟脱氧核糖-磷酸-为骨架,排列在外侧碱基堆积在内侧

DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)相间。

DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G

C）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。2.0nm小沟大沟DNA的双螺旋结构的形成5´3´5´3´5´3´5´3´磷酸核糖碱基T-A碱基对C-G碱基对氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。

1.两条反向平行的脱氧核苷酸链绕同一中心轴，形成右手螺旋的结构。

2.磷酸-戊糖骨架位于外侧，两条链上的碱基以A=T、G

C相连，构成碱基平面，位于螺旋内侧。

3.螺距为3.4nm，旋转一周为10个碱基对。螺旋直径为2.0nm。

4.majorgrooveminorgroove5.氢键：维持双螺旋横向稳定

6.碱基堆砌力：维持纵向稳定DNA二级结构要点总结维持DNA结构稳定的作用力

(1)碱基堆积力(basestackingforce)碱基堆积力是维持DNA结构稳定的主要作用力。碱基有规律的堆积可以使碱基之间发生缔合，这种作用力称为碱基堆积力。由于碱基的层层堆积，在DNA分子内部形成一个疏水核心区，有助于氢键的形成。

(2)氢键互补碱基对之间形成氢键：G≡C，A=T

(3)离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键，消除了DNA自身各部位之间因负电荷而产生的斥力，增加了DNA分子的稳定性。DNA双螺旋的不同构象

Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋，它是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维在92%相对湿度下进行X-射线衍射图谱为依据进行推测的，这是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。在不同的湿度和离子强度时，还可形成A、C、Z等各种象。DNA结构的多态性

在以钾或铯作反离子，相对湿度为75%时，DNA分子的X-射线衍射图给出的是A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RAN双连分子均采取A构象。A-DNA构象

1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X-射线衍射图谱时出人意料地发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺旋，与右手螺旋的不同是螺距延长(4.5nm左右)，直径变窄(1.8nm)，每个螺旋含12个碱基对，分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列，有如“之”字形一样，因此叫它Z构象(英文字Zigzag的第一个字母)。

Z-DNA构像

Z-DNA是左手螺旋，构象中的重复单位是二核苷酸而不是单核苷酸；而且Z-DNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。进一步的分析还证明，Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的， 比如CGCGCGCG或者CACACACA。Z-DNA构象的特点A-DNA和Z-DNA当DNA处于转录状态时，DNA模板链与由它转录所得的RNA链间形成的双链就是A-DNA。Z-DNA构象在转录区上游离转录区近时，抑制转录。只有当Z－DNA变成B－DNA后，转录才被活化。

Z－DNA构象有转录起始的调节活性。DNA双螺旋结构的多样性三种DNA双螺旋构象比较ABZ外型粗短适中细长螺旋方向右手右手左手螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm碱基直升0.23nm0.34nm0.38nm每圈碱基数1110.412碱基倾角1901090糖苷键构象反式反式C、T反式，G顺式大沟很窄很深很宽较深平坦小沟很宽、浅窄、深较窄很深回文结构和镜像重复DNA碱基顺序相关的特殊二级结构:1)回文序列:是指DNA某一片段旋转1800后,顺序不变的序列，回文序列中的单链可形成发夹结构。双链可形成十字架结构。这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现.核酸分子中的回文序列

回文序列中的单链可形成发卡结构

双链回文序列可形成十字架结构*镜像重复存在于同一股上的某些DNA区段的反向重复序列。

AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCTTCATATCTTCTCCCTTCCTAG三链DNA既可以是B-DNA与另一条DNA链结合成的链间的三链DNA，又可以是B-DNA与其自身的一条链结合形成的链内的三链DNA。

三链DNA分子内三链DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中发现。其形成要求双螺旋中存在连续的嘌呤或嘧啶序列，而且必须是镜像重复序列。DNA分子内的三链结构

多聚嘌呤多聚嘧啶DNA分子间的三链结构DNA三链间的碱基配对T-A-TC-G-C

三螺旋DNA可能参与基因转录及复制的调控，其作用仍待进一步证实。由于基因调控部位常富含多聚嘌呤-多聚嘧啶区，如果另一单链DNA结合到这些区域形成三链DNA，在一定条件下可能会阻止一些序列特异性蛋白质的结合，如转录起始因子等，从而影响基因的表达。这也为肿瘤等疾病提供新的潜在的治疗手段，如设计针对特定DNA靶位的人造寡核苷酸片断或其衍生物，和这些靶位点特异结合后调节某些基因的表达，抑制细胞分裂或杀死这些非正常细胞。三链DNA的生物学功能四.DNA的三级结构

在DNA二级结构基础上，双螺旋的扭曲或再次螺旋就构成了DNA的三级结构，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。常见的三级结构有：1.超螺旋

2.染色体和核小体DNA超螺旋结构

超螺旋

当DNA分子的两端是固定的，或是环状分子，则这种额外的张力就不能释放掉，DNA分子就会发生扭曲，用以抵消张力。这种扭曲称为超螺旋，即双螺旋的螺旋。

在生物体内，绝大多数的DNA是以超螺旋的形成存在的。螺旋和超螺旋电话线螺旋超螺旋环状DNA形成的超螺旋超螺旋结构的特点：致密性

所有细菌、某些病毒以及真核细胞中的线粒体或叶绿体中的DNA都是环形分子。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反DNA超螺旋结构形成的意义

使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；

推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。DNA双螺旋染色单体超螺线管螺线管串珠状多核小体核小体染色体与DNA的关系染色体与DNA的关系

细胞周期

染色质和染色体

染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。

染色质（chromatin）是细胞间期细胞核内能被碱性染料染色的物质。基本化学成分为脱氧核糖核酸核蛋白，它是由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成的复合物。

染色体的化学成分及组成DNA

组蛋白非组蛋白

少量RNA化学成分核小体核心DNA组蛋白H2A、H2B、H3、H4连接段DNA180-200bp组蛋白：Hl、H2A、H2B、H3及H4染色体中的蛋白质6.8:140:11000:18000:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosome组蛋白的一般特性①进化上的极端保守性②无组织特异性③肽链上氨基酸分布的不对称性④组蛋白的修饰作用⑤富含赖氨酸的组蛋白H5

非组蛋白

一般特性：

①非组蛋白的多样性非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。

②非组蛋白的组织专一性和种属专一性。

影响DNA高级结构的酶

L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。（一）I型DNA拓扑异构酶（二）II型DNA拓扑异构酶（三）DNA拓扑异构酶催化反应的实质原核生物两类拓扑异构酶

拓扑异构酶I

通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，反应无需供给能量。

拓扑异构酶II

则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称促旋酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。

细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制，使细胞内DNA保持在一定的超螺旋水平。拓扑异构酶Ι通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，反应无需供给能量

原核拓扑异构酶I的作用机制连接数=n连接数=n+1穿越断口和使两端连接切割abcd拓扑异构酶Ⅱ可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称促旋酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。（三）DNA拓扑异构酶催化反应的实质：

其本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂DNA，即其断裂及连接反应是相互偶联的。DNA的变性和复性

变性（Denaturation)

DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。

增色效应(Hyperchromaticeffect)在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。融解温度（MeltingtemperatureTm)

变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。生理条件下为85-95℃影响因素：G+C含量，pH值，离子强度，尿素，甲酰胺等复性（Renaturation)热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。减色效应（Hypochromaticeffect)

随着DNA的复性，260nm紫外线吸收值降低的现象。

C值反常现象（C-valueparadox)C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。

真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。

C值矛盾第二节基因组的结构与功能

基因（gene）：是核酸的中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。

从生物化学上来说指的是一段DNA或RNA（病毒）顺序，该顺序可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体。

从遗传学上来说代表1个遗传单位、1个功能单位、1个交换单位或1个突变单位。

基因组（gencme）：细胞或生物中，一套完整单倍体遗传特质的总和（包括一种生物所需的全套基因及间隔序列）称为基因组。

基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸分列中的分布和排布情况，基因组的功能是贮存和表达遗传信息。

原核生物的染色体及其基因

原核生物染色体特征：原核生物DNA一般位于核区里（拟核）。细菌DNA是一条共价、闭合双链分子，通常也称为染色体。一般情况下含有一条染色体。原核细胞都是单倍的。大都带有单拷贝基因；整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。（无内含子）原核细胞原核细胞染色体上的DNA存在形式原核生物基因组结构与功能的特点1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。2.基因组中只有1个复制起点。3.具有操纵子结构。4.基因序列是连续的，无内含子结构。5.编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%。（5%，95%）6.基因组中的重复序列很少。7.具有编码同功酶的基因（isogene）8.细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。9.原核基因的基本结构特点：

●基因组很小，大多只有一条染色体●

结构简炼●存在转录单元(trnascriptionaloperon)

多顺反子(polycistron)X174D-E-J-F-G-HmRNA蛋白J、F、GHDEE.coli色氨酸操纵子9个顺反子9个酶(第六章)1、原核生物基因组结构特点原核生物和真核生物基因组结构特点比较

●有重叠基因（Sanger发现）基因内基因部分重叠基因一个碱基重叠

真核生物的染色体及其基因

真核细胞染色体特征：真核细胞的体细胞染色体都是二倍体，而性细胞的染色体为单倍体。

1、分子结构和数目相对稳定;

2、能够自我复制;

3、能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程;

4、能够产生遗传的变异。真核细胞真核细胞染色体上的DNA存在形式

真核生物基因组的结构

(一)真核基因的基本结构

1.结构基因、内含和外显子、断裂基因。

（1）结构基因（structuralgene）指能转录成为mRNA、rRNA或tRNA的DNA顺序。

（2）内含子和外显子真核生物的结构基因是不连续的，编码序列被非编码序列打断，在编码序列之间的序列称为内含子（intron），编码序列称为外显子（extron）。

（3）断裂基因（splitgene）在真核类结构基因组中，编码顺序被许多称为内含子的非编码区分割成几段称之。顺式调控元件

顺式调控元件（cis—actingelements）指与结构基因表达调控相关，能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。能与顺式作用元件结合调节基因转录活性的蛋白质因子称为反式作用因子（trans—actingfactors）。顺式调控元件有：（1）启动子（promoter）（2）上游启动子元件（upstreampromoterelementsups）（3）反应元件（responseelements）（4）增强子（enhancer）和沉默子（silencer）（5）加尾信号真核生物基因组结构特点●真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜●单顺反子●基因不连续性断裂基因（interruptedgene）、内含子(intron)、外显子(exon)●非编码区较多多于编码序列(9:1)●含有大量重复序列■不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等功能：主要是编码蛋白质。

■中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101~104。如：rRNA、tRNA

一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用

■

高度重复序列：拷贝数达到几百个到几百万个。

●卫星DNA：A·T含量很高的简单高度重复序列。第三节DNA的复制“DNA复制机构”的研究思路：命题→提出假说：半保留复制→研究方案、选材、研究路线、技术方法→进行试验→得出结论。定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。DNA的半保留复制（semi-conservativereplication）DNA的半保留复制

DNA复制的三种假设DNA复制的三种假设实验证据（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl1958年，Meselson和Stahl的著名实验：同位素标记，密度梯度离心。CsCI密度梯度离心实验测定半保留DNA复制的结果DNA的半保留复制“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“light”DNA“Hybrid”DNADNA半保留复制的生物学意义：

DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。

DNA的半不连续复制（semidiscontinuousreplecation)

Okazaki（冈崎）于1968年通过H3–脱氧胸苷（H3–dT）标记实验证实了半不连续复制。

1.实验材料：T4感染的E.coli野生型phage–T4mutantT4（连接酶突变）

2.实验系统：H3–dT标记E.coli；phage–T4感染；密度梯度离心。检测标记DNA在不同时间合成的情况。

3.实验结果：

⑴短时间内，首先合成较短的DNA（冈崎片段），接着出现较大分子DNA。

⑵突变型连接酶T4中，大片段DNA很少或无。

⑶半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段（冈崎片段），另一半出现在长片段DNA中。结论：DNA复制是半保留半不连续复制。DNA复制的连续的、半不连续的和不连续的模型边解链边复制

DNA的复制是边解链边合成

⑴实验证据：SV40复制的早期电镜照片，复制部分和未复制部分。⑵复制从原点（origin)的特定位点开始，形成复制眼eplicationeye),逐步向未复制部分扩大。复制叉（reolixationfork)在非复制DNA的旁边复制的DNA被看成是复制眼⑶单向或双向复制放射活性标记的不同密度可被用于区别不定向和双向复制复制可能是不定向或双向的，这决定于在起始点形成1或2个复制叉。

实验：SV40为环形分子，5224bp，上有1个ECORⅠ切点。复制中，用ECORⅠ切复制中的SV40，得到复制眼大小不同的系列DNA分子，可看到随复制眼扩大，两侧DNA变短，说明复制从原点开始：①双向进行大多数DNA分子如此，两侧对称，双向不对称。②单向进行两侧不对称，滚筒式也属单向复制。③真核一般为多起点复制。起始点的位置和复制叉的数量决定复制的限制性片段的种类，通过它的电泳途径分开。复制单位

1.复制子：由一个原点（origin)引发的复制，称为一个复制子，即一个复制单位。包含一个origin和一个terminus。

原核，只有一个复制原点，因此只有一个复制子。

真核，具有多个复制原点，因此有多个复制子。

2.染色体DNA复制子一般只复制一次。

3.染色体外遗传元件的复制子

染色体外遗传元件包括：

原核生物细胞中的质粒，噬菌体。

真核生物细胞中的线粒体、叶绿体、病毒。

染色体外遗传元件一般为单复制子（只有一个origin),但为多次复制，为多拷贝。

4.染色体DNA与染色体外元件复制是否同步

真核生物的线粒体和叶绿体复制一般与核DNA同步或稍滞后，原核生物的染色体DNA和质粒（噬菌体）一般不同步，但整合后同步。

整合前质粒为θ式或滚筒式复制，整合后为一个复制子。质粒为双向复制。

实验：E.coli温敏型突变体。

30℃复制正常，42℃时，E.coli复制起动受阻，代之以质粒origin开始的单向复制。

说明复制起始是受调控的。DNA复制系统的酶和蛋白因子

DNA复制系统涉及多种酶和蛋白因子，真核生物复制系统组分更复杂，原核生物复制系统组分如下：

DNA聚合酶（校正功能的酶）

引物酶（多组分）

解链蛋白

拓扑异构酶（解旋）

连接酶

除去引物的酶拓扑异构酶（topoisomerase)

⑴拓扑异构体：具有不同螺旋数的同一DNA分子两种异构体（topoisomer)

⑵拓扑异构酶：可使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。

功能：

与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNAnick，DNA的一条链进行解旋旋转而改变DNA分子的拓扑状态。

参与复制、转录、重组。效应：拓扑异构酶可使DNA发生：

连环化（catenate)

脱连环化(decatenate)

打结（knot)

解结（unknot)拓扑异构酶的种类：Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型：MW=100kD，单肽链，含3–4个Zn。作用：每次改变一个连环数。

结合DNA，使该处熔解。

形成酶－DNA复合物。

切割双链中的一股，使DNA中的一股链穿越切割点。

断裂单链连接。

Ⅱ型：也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。

作用：使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数I型拓扑异构酶作用机理示意图拓扑异构酶Ⅱ的作用机制拓扑异构酶Ⅱ的作用机制

DNA链解旋，解链的酶和蛋白

1.DnaB：解旋酶，引发体成员，使复制叉形成，并在以后结合于一个复制叉，推动复制叉向前延伸（helicase)。需ATP。

生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，重组等非复制过程。

2.SSB：单链结合蛋白（single–strandbindingprotein)

SSB结合于解旋的DNA双链的单股链上。SSB的作用：

使DNA单链保持一种伸展构象，能作为模板；

使解开的单链不形成发卡结构；

保护DNA单链不受Dnase水解。SSB特性：

结合DNA单链有协同性（coperativity)；

SSB可重复使用，在滞后链上不断摆动，使冈崎片段合成。

引物酶及引发体

1.DNA合成以RNA为引物

实验：Reiji以α–32P–NTP标记＋未标记TP为底物。

引发合成后，用稀碱处理，32P在DNA中出现，证明RNA为引物。

2.引物酶（primerase)

DnaG

RNA引物由引物酶合成。

意义：减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解，从而减少了复制错误。

3.引发体（primosome)

引物酶不能单独合成RNA引物，必须与其它蛋白因子形成引发体才能引发RNA引物合成。

DNA聚合酶（DNApolymerase)

原核DNA聚合酶有三种：DNApolymerase

Ⅰ

DNApolymeraseⅡ

DNApolymeraseⅢDNApolymeraseⅢ全酶组成：

①在复制叉处为一二聚体

②核心酶（coreenzyme)：α、ε、θα：聚合作用ε：3′→5′外切θ：与亚基结合有关

③DNApolymeraseⅢ的亚基γ、δ、δ′、χ、ψ提高反应速率和持续性。

④β-亚基：使DNApol能结合在DNA上。

β-亚基结合于DNA时消耗ATP：ATP→ADP＋Pi

β-亚基如同一个夹子（clamp)，使DNApolⅢ结合于DNA。

⑤τ亚基：使两个DNApol单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。在若干阶段，DNApolⅢ全酶被装配，产生一个酶复合体，它合成两个新链的DNA。polⅢ的每一个催化中心合成一个子链。DnaB负责在复制叉上向前移动。引发体拖着一条DNA链通过。连接酶（ligase)

DNA随后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：

被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；

两链相邻；

每次只能连接一个切口；

使一条链的5′-P与另一链的3′-OH形成磷酸二酯键。T4Ligase特性：

可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA。

可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平齐末端切口。原核DNA的复制

原核生物DNA的复制过程是复杂的顺序性过程，涉及多种酶和蛋白因子，复制过程是多种酶和蛋白因子协同作用的结果。

复制的过程DNA复制起始DNA链的延伸切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段复制的起始

E.coli的DNA复制起始指从origin（原点）开始的起始过程，这一过程不同于随后链上冈崎片段的起始。

E.coli的DNA复制起始包括：

起始位点识别－解链－解旋－引发体组装

1.复制原点（origin)

E.coli复制原点（oriC）位于天冬氨酸合成酶和ATP合成酶操纵子间，共245bp。组成：

含有2个系列的重复单位，3×13bp4×9bp均富含A/ToriC在不同原核生物中有同源性细菌的复制原点A为构成DnaA蛋白识别位点的9bp重复单位，箭头表示富含AT的重复单位；n代表任何核苷酸。9bp（A位点）为DnaA蛋白识别位点。复制起始

⑴DnaA识别并结合于oriC的9bp的重复单位，每20－40个DnaA形成大的复合物，负超螺旋oriC包裹在外，HU蛋白参与并促进这一过程。

⑵上述复合体使13bp重复单位熔解。用核酸酶P1（可作用于ssDNA）证明解链部分约为45bp。

⑶DnaB（解螺旋酶）和DnaC（引发体成员）蛋白进入熔解区形成前引物复合体。

⑷引发体其他成员，主要是DnaG（引物酶）参入成引物体。

⑸SSB和旋转酶（拓扑异构酶）参入。

⑹引发体合成先导链的RNA引物。

⑺DNApolymeraseⅢ组装和复制叉上二聚体形成。

⑻在RNA引物3′端DNA开始聚合。DNA复制的延伸

1.复制体（replisome）的形成。起始复制形成的复制酶和相关蛋白在复制叉形成的超分子结构，在不同系统（噬菌体、E.coli、动物、动物病毒）中的复制体组分虽有差异，但功能十分相似。

复制体包括两种：

1.Ori的复制体复制起始后延伸过程的复制体。

2.延伸过程的复制体

非对称的DNApolⅢ二聚体

DnaB

随从链上的SSB和引发体

3.延伸过程

前导链和滞后链由同一polⅢ二聚体延伸

主导链(leadingstrand)：以亲代DNA3′－5′链为模板，不连续合成

滞后链（laggingstrand)：以亲代的5′－3′链为模板，不连续合成。

DNA滞后链合成与主导链不同步。

⑴位于滞后链的引发体，在合成引物后DnaG（引物酶）可将模板链提起（或成环）。使RNA引物3′端位于DNApolⅢ处polⅢ的每一个催化中心合成一个子链。DnaB负责在复制叉上向前移动。引发体拖着一条DNA链通过。

⑵DNApolⅢ在RNA引物3′端延伸DNA随从链。

⑶解链的滞后模板链被SSB结合，保持模板为单链状态，并保护其不被核酸酶水解。

⑷随冈崎片段的延伸，SSB被priA除去，此过程需ATP供能。核心聚合酶与β–卡箍在冈崎片段完成时是分离的，在开始时重新缔合。复制叉处前导链和随后链同时复制的工作模型复制的终止

关于复制终止的研究，无论真核或原核都有不少研究资料，但也有很多细节未搞清。

E.coliDNA的复制终止机制：

1.E.coliDNA的复制终止终点

AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT

TTAATCATACAACATTGATTTCA在E.coli中复制终止点远离复制叉真正相遇的位置

复制叉在此位点相遇（forksmeet）。

终止序列可被tus蛋白（tus基因编码）识别，并结合于其上。

2.终止的调节：在终止点Forksmeet两侧各有几个短序列，如：terE.D.A.terC.B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上时。以上似乎构成一个“replicationforktrap”。

上述ter大约相距100kb3.二个复制叉相距约100kb时速度放慢，通过ter来协调两复制叉到达终点的时间。Tus不对称地结合在ter上和只在一个方向上阻止复制。DNA复制的保真机制

长期进化过程中，使生物体DNA复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确，遗传稳定。

1.DNApolⅠ和Ⅲ的3′－5′活性DNApolⅠ有两个结构域：

⑴大结构域含一个荷正电，直径2nm的裂缝，是DNA结合部分。DNA一旦结合，裂缝即被关闭，这时，DNA只能在裂缝中前后滑动。

⑵小结构域含核苷酸结合部位，两结构域相距3nm。

⑶当新合成的DNA中含错配核苷酸对时，双螺旋发生变形，因而不能在裂缝中向前滑动，只能后移，这时3′－5′外切酶激活，切除错配核苷酸。

⑷错配核苷酸切除后，聚合反应继续进行。3′外切核酸酶对复制的校对作用

2.RNA引物起始复制，引物最终除去，减少错配。开始合成错配率高，短核苷酸序列中的错配不易校正。

3.修复系统有多种机制和酶

真核生物的DNA复制

真核生物的复制子

复制时期S期细胞周期四个时相多个复制起始点

多个复制子（replicon)复制起点复合物

在酵母中，与ARS结合的是MW～400kD的蛋白ORC。ORC（originrecognitioncomplex）。

ORC由6个蛋白组成，其结合于A1和邻近的B1元件上，识别了ori的同时保护了ori区。ORC在整个细胞周期中都与ARS结合。

转录因子ABF1结合到B3位点，上述促进和增强了起始作用。极小的原点在由13mer和9mer重复区之间的距离确定真核的复制酶及蛋白因子

1.真核生物DNA聚合酶

对真核DNApol了解较少，其原因是：

研究材料突变体少。

酶纯化困难。真核DNApol种类

DNApolα：含量最高，负责合成RNA引物和iDNA（initiatorDNA,起始DNA）。形成RNA–iDNA引物，无3′－5′活性。

∴错配频率高，具引物酶活性。

DNApolδ：无合成引物功能，有3′－5′外切活性，负责合成延伸前导链和滞后链的冈崎片段（延伸）。

DNApolβ和ε：可能与修复有关。

DNApolγ：是存在于线粒体中的DNA复制酶。与复制有关的细胞因子

PCNA(proliferatingcellnuclearantigen；增殖细胞核抗原)同源三聚体复合物，结构为环形。功能类似于E.coliDNApolⅢβ(clamp)，使DNApolδ有持续合成能力。

RFC（复制因子C；ReplicationfactorC）功能：⑴依赖于DNA的ATPase，其ATP酶活性由PCNA激活。

⑵引物合成后取代polα，使polδ继续延伸DNA。

RNaseHⅠ/FEN1(flapendonuclease；RNaseHI：内切酶切除5′端RNA引物，但剩余引物最后一个N。FEN1：5′－3′外切酶，切去引物最后一个N。

④Dna2：解旋酶/FEN1（内切酶活性）Dna2解旋酶：依赖DNA的ATPase活性，使δ合成的片段从模板DNA上置换下前一个冈崎片段的引物，形成flap，再由FEN1内切酶活性切除引物。

⑤连接酶I：连接两个冈崎片段。

真核生物DNA复制

1.起始：Polα→RFC→组装PCNA·polδ·RFC复合物

2.RNA－iDNA引物

3.DNApolα/δ转换

4.冈崎片段的引物切除和片段连接

SV40的前导链至少能连续合成5～10kb。

滞后链：新的冈崎片段合成时，在遇到前一个冈崎片段时停止。RNaseHI/FEN1切除引物。由DNApolα合成的iDNA在Dna2解旋作用后被新生的冈崎片段置换，再被FEN1切除，形成的空隙由DNApolδ（或ε）负责填补。（实际合成中，后一个冈崎片段和前一个冈崎片段引物后是连续的？）。

连接酶I连接冈崎片段。真核生物端粒的复制

1.端粒（telomere)

端粒是真核染色体的末端序列。

端粒的生物学功能是保持染色体的稳定，它决定着细胞的寿命。

2.在DNA复制中线性DNA末端可能变短的问题

DAN复制需要引物，而RNA引物最终被降解，可能导致DNA端部不断变短，信息丢失。

3.端粒的结构

⑴DNA端粒由简单而串联重复的序列组成

人和其他脊椎动物：AGGGTT

纤毛原生动物四膜虫：GGGGTTGGGGTTTT面包酵母：G1－3TG1－5A

富含G；

长度可达几百到几千碱基对。

⑵端粒DNA序列有取向性：染色体末端，富含G的单链为5′－3′延伸，并长于富含C的单链12－16net。

⑶染色体末端与特定蛋白形成复合物。

⑷端粒的不寻常结构：vInvitro(体外，实验室条件下）可产生G－G配对。

3′端12～16bp突出序列形成回折结构，甚至形成4链结构，其中G形成G四联体，并为K+或Na+稳定，且四联体上、下堆积。

端粒的复制：

端粒酶：端粒酶携有一短的RNA分子，AccccAAc，可与G重复序列配对。

端粒酶的作用机制：酶的RNA分子与端粒DNA配对，以RNA为模板，进行类似逆转录合成DNA→酶解离，再配对→延伸端粒，反复可达数百次。

端粒酶活性：在生殖细胞中有活力，在体细胞中无活性或活性低。

端粒酶在细胞永生化和肿瘤增殖的维持中起重要作用。

原癌蛋白，雌激素等很多因子可激活端粒酶。四膜虫中端粒的形成真核生物中DNA的复制特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。3、真核生物有多种DNA聚合酶。

DNA复制的其它方式

1.线性双链

2.环状DNA复制

θ型，双向

滚筒式，单向

D型，单向，在动物线粒体中有。

滚动循环产生一个多聚单链尾巴。滚动循环可用于不同的目的，这依赖于移出尾巴的命运……φX174RF是一个合成单链病毒圆环的模板腺病毒DNA的复制是分别从分子的两端起始并通过链的移动继续进行双链环状、θ型复制、双向等速DNA损伤的来源DNA突变DNA修复第四节DNA的损伤、突变、修复1.DNA损伤的来源⑴物理因素：如，电离辐射⑵化学因素：

①烷化剂

硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）

使碱基烷基化，如产生7－甲基G、m7G、m3A。导致复制时碱基错配。

②碱基类似物5－BrU－T转换。

③黄曲霉素B1·2－2－酰－氨基芴、苯并芘插入移码

④亚硝酸盐使A、C、G脱氨基形成U、I、X。

⑶碱基的自发改变和损伤

复制碱基错配碱基互变异构：酮式→醇式

DNApol、核酸酶、其他复制因子突变。

DNA的自发损伤。

⑷氧自由基伤害

3.碱基缺失和插入4.嘧啶二聚体T－T5.DNA链断裂电离辐射或博莱霉素2.DNA突变1.点突变：突变由单一碱基改变产生缺失转换（transition)

PY1→PY2颠换（transversion)

Py(Pn)→Pn(Py)基因突变的类型2.移码突变3.校正突变4.点突变的结果

⑴沉默突变

⑵致死突变

⑶渗漏突变

⑷进化突变DNA修复系统功能错配修复纠正错配碱基切除修复切除突变的碱基核甘酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNADNA的修复1、错配修复●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化●甲基化紧随在DNA复制之后进行●根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基

根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图发现错配碱基在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配点的DNA双链结合MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链

甲基化指导的错配修复示意图错配碱基位于切口3’下游端，错配碱基位于切口5’上游端，（1）碱基切除修复一些碱基在自发或悠变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对2.切除修复胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶如果复制发生就会产生一个突变.糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-β-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖甘-磷酸键切开。DNA连接酶连接利用DNA聚合酶I切除损伤部位，补上核苷酸（2）核苷酸切除修复1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3）DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA连接酶将切口补平识别损伤部位损伤的两边切除几个核苷酸DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链DNA连接酶将切口补平3、重组修复和sos修复4、DNA的直接修复（光修复）在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对第五节

DNA的转座（一）基本概念：DNA的转座：由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子（transposon）：存在与染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。（二）转座子的类型和结构特征原核生物转座子的类型：1、插入序列(insertionalsequence,IS)2、复合转座子(compositetransposon)3、TnA家族1、插入序列(IS)IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。

λ：：IS1转座子在序列末端有倒置重复序列。在这个例子中靶位点有5bp碱基，转座子末端有9bp。复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列2、复合转座子(compositetransposon)(三）转座作用的机制复制性转座子非复制性转座子反转录病毒整合入宿主DNA中的分子机制，其本质是转座。反转录转座子（retrotransposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件第六节RNA的结构与功能StructureofRNARNA的一般结构特征1）主要存在于细胞质中。2）单链分子，碱基组成不遵守Chargaff规则。3）碱基U代替了T。4）不如DNA稳定。RNA上C2’-OH是游离的，易发生不良反应。RNA的一级结构

R