SN 1375-2004玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法2004-06-01发布2004-06-01发布国家质量监督检验检疫总局I本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。Ⅱ玉米细菌性枯萎病(Stewart'sBacterialWiltofCorn)是玉米上的一种毁灭性的病害，我国尚无该病害发生。该病可以通过带菌种子远距离传播(种传),在病区则以昆虫传播为主。其病原菌Pantoeastewartii(Smith)Mergaertetal.,异名：Erwiniastewartii(Smith)Dye,中文名称：斯氏泛菌。在本标准规定了进境植物检疫中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28—1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3.1玉米细菌性枯萎病菌的分类地位Dye,属原核生物总界Procaryotae细菌界Bacterium,薄壁菌门Gracilicutes,肠杆菌科Enterobacteri-无鞭毛，两端钝圆，单生或以短链形式存在。该病菌在玉米上引发的玉米细菌性枯萎病是一种典型的维酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫吸附分离试验利用血清学技术具有特异性强的优点，与常规生检验中所需的药品均为分析纯。5.1药品碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl₂)、吐温-20(Tween-20)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、双氧水(H₂O₂)、四甲基联苯胺、二甲基亚砜、蛋白胨、蔗糖5.3培养基改良W氏培养基。制作方法见附录A。26对照菌株和抗血清不同种的菌；革兰氏染色中的阴性对照菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)。对照菌在应用中需配制成10'cfu/mL浓度的菌悬液。检验中所需抗体均为同种P.stewartii抗血清，其使用浓度依其效价而定。不少于0.25kg。待检样品在0.25kg以上、1kg以下的，检验样品可适当减少，但不得低于0.125kg。将检验样品用0.1%升汞(HgCl)溶液进行表面消毒处理1min～2min,或用3%～5%的次氯酸钠(NaOCl)表面消毒处理5min～15min,然后无菌水冲洗三次，无菌条件下晾干。对于药剂拌种的种子样品，可用95%乙醇(CH₃CH₂OH)洗去表面药剂后，再用无菌水冲洗三次，无菌条件下晾干，7.2.1.2悬液的制备将表面消毒后的检验样品粉碎，放到三角瓶中，加适量0.85%生理盐水室温浸泡4h～6h或置于4℃冷藏箱中过夜。之后将种子浸泡液移入离心管，在1000r/min下离心10min,弃去沉淀，取上清液转入另外离心管，10000r/min离心15min,弃去上清液，加2mL生理盐水使之悬浮，得到悬液。将悬7.2.2.1包被在酶联板板孔内每孔加入200μL以包被缓冲液稀释的SPA,保湿条件下置于4℃培养箱中过夜。7.2.2.2洗涤7.2.2.3加第一抗体向板孔中加注200μL经稀释的第一抗体，保湿条件下置于37℃培养箱中孵育2h。方法见7.2.2.2。7.2.2.5加检测悬液向板孔中加注检测悬液，每孔200μL,同时件下置于37℃培养箱中孵育3h。方法见7.2.2.2。7.2.2.7加第二抗体向板孔中加注200μL经稀释的第二抗体，保湿条件下置于37℃培养箱中孵育2h。7.2.2.8洗涤方法见7.2.2.2。7.2.2.9加酶标记A蛋白向板孔中加注200μL经稀释的酶标记A蛋白，保湿条件下置于37℃培养箱中孵育2h。方法见7.2.2.2。向板孔中加注100μL底物反应液，黑暗条件下反应20min左右，直至阳性对照孔显出明显的颜色。向板孔中加注100μL2mol/L硫酸终止颜色反应。在酶标仪上以490nm波长测定各孔的OD值，读数前以空白孔调整为0。将样品孔和阴性对照孔的读数进行比较，如果样品孔与阴性孔的OD比值大于2,则检测结果判定为阳性，样品中可能带有玉米细菌性枯萎病菌P.stewartii,需进行下一步7.3病菌的分离和鉴定工作，7.3病菌的分离和鉴定7.3.1病菌的免疫分离7.3.1.1抗血清包被在聚苯乙烯培养皿底部反面用记号笔划出五个直径为1.5cm的圆形区域作为标本区域，然后再在培养皿中的每个标本区域内，加以包被缓冲液稀释的玉米细菌性枯萎病菌抗血清300μL,涂满整个区域。培养皿加盖儿于湿盒内，37℃孵育3h～4h或在4℃冰箱中过夜。孵育1h。7.3.1.3加菌悬液除去RTP液，向培养血中加7.2.1.2制备的菌悬液，悬液应覆盖整个培养皿的底部，培养皿加盖儿置于湿盒内，在37℃恒温箱中孵育1h或在4℃冰箱中过夜。同时设阴、阳性及空白对照(空白对照用生理盐水)。除去残留的RT液，向培养皿中倒入40℃~50℃的改良W氏培养基，能够覆盖整个培养皿的底部将培养皿放入30℃恒温箱中培养，定时观察菌落的出现情况。从中挑取淡黄色或黄色的、稍隆起、7.3.2分离菌的鉴定按GB/T4789.28-1994中2.2规定的方法进行。如果染色结果为革兰氏阴性菌，则继续进行下一步7.3.2.2鞭毛染色工作；如若染色结果为革兰氏阳性菌，则判定最终鉴定结果为检验样品中不带有玉米细菌性枯萎病菌P.stewartii。7.3.2.2鞭毛染色按GB/T4789.28—1994中2.7规定的方法进行。如果分离菌经镜检发现无鞭毛，则继续进行下一步7.3.2.3分离菌的生理生化测定工作；如若发现347.3.2.3生理生化测定如分离菌的生理生化测定结果与Pantoeastewartii的生理生化特征相符合，可据此判定最终鉴定终鉴定结果为阴性，样品中不带有玉米细菌性枯萎病菌P.stewartii。7.4结果评定如果7.2.2.14检测结果为阳性，且在7.3.2中各项鉴定结果均为阳性，则判定最终检疫鉴定结果有玉米细菌性枯萎病菌P.stewartii。8样品和菌株的保存保存样品应不少于1kg。船运散装玉米样品的保存应按舱别、层次、品种、等级分别存放；种用玉米样品的保存按批号或品种分别存放。保存样品经登记和经手人签字后置于低温干燥、防虫防鼠处妥善保存两个月。发现玉米细菌性枯萎病菌的样品至少要保存六个月，已备复验、谈判和仲裁。保存期满分离并鉴定为玉米细菌性枯萎病菌P.stewartii的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签试剂及培养基的配制方法A.1试剂碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g,碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g,叠氮化钠(NaN₃)0.2g,加无菌水溶解后，最终定容至1000mL。磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g,氯化钠(NaCl)8g,氯化钾0.1mol/LpH7.4PBS磷酸缓冲液加吐温-20至0.05%。A.1.1.4底物缓冲液定容至1000mL。A.1.1.5底物反应液TMB(四甲基联苯胺，用二甲基亚砜配成10mg/mL)100μL加3%双氧水100μL混合后加底物缓冲液至10mL。A.1.1.6A蛋白(SPA)以包被缓冲液稀释(稀释倍数参考产品使用说明)。A.1.1.7酶标记A蛋白(HRP-SPA)以PBST稀释(稀释倍数参考产品使用说明)。A.1.2表面消毒液升汞(HgCl)1g,浓盐酸(HCl)2.5mL,水1000mL。A.1.3.1RT液氯化钠(NaCl)2g,氯化钾(KCl)0.05g,氯化钙(CaCl₂)0.05g,碳酸氢钠(NaHCO₃)0.25g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.25g,吐温-20(Tween-20)1mL,无菌水1000mL,pH7.4。A.1.3.2RTP液RT液加1%蛋白胨。A.2改良W氏培养基蔗糖(C₁₂H₂₂O₁)10g,蛋白胨5g,磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.5g,硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.25g,琼脂18g,抗坏血酸1g,蒸馏水1000mL,调整pH值至7.2～7.4,120℃湿热灭菌20min。56(规范性附录)Pantoeastewartii(syn.Erwiniastewartii)的生理生化特征醇产酸，不能利用水杨苷；水解淀粉阴性，无解脂能力；耐受5%～7%的氯化钠；在0.3%牛胆酸钠存在Pantoeastewartii(syn.Erwiniastetvartii)与欧文氏菌属中各种间生理生化反应区别见表B.1。表B.1Pantoeastewartii与欧文氏菌属(Erwinia)中各种间的生理生化反应的区别philamal-rifa-