第09章 维生素类药物的分析-3-2012

药物分析学（第十四章）维生素类药物的分析（3）本节教师：韩海（博士/副教授)暨南大学药学院Tel-mail:thanhaik@QQ:560118562013.11.06维生素D的分析维生素D简介维生素D为类甾醇衍生物，具有抗佝偻病作用。VD家族中最重要的是麦角骨化醇（VD2）和胆骨化醇(VD3)。其主要生理功能是促进钙磷的吸收，有利于新骨的生成与钙化。主要存在于肝、奶、蛋黄中。儿童缺乏VD患佝偻病成人缺乏VD患骨质疏松病。胆甾醇7-脱氢胆甾醇维生素D3维生素D2麦角甾醇甾醇衍生物结构及性质维生素D2、维生素D3

（ChP收录）★[结构特点与分析方法的关系]1．开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。2．手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。3．多烯：可进行紫外检测,不稳定.结构及性质性质：1.性状:无色针晶或白色结晶状粉末2.溶解性:脂溶性3.不稳定性:易氧化,对酸也不稳定.4.旋光性:具手性碳5.可发生甾类化合物的显色反应6.紫外吸收:265nmE1%1cm（VitD2：460-490,VitD3：465-495）★鉴别试验★

（一）显色反应：1.醋酐-浓硫酸反应：D2:黄

红

紫

绿。D3:黄红

紫、蓝绿绿2.三氯化锑反应:橙红色，渐变粉红

3.三氯化铁反应:橙黄色鉴别试验（二）维生素D的比旋度药物溶剂浓度比旋度值维生素D2

无水乙醇40mg/ml+102.5°～+107.5°维生素D3

无水乙醇5mg/ml+105°～+112°注意事项应于容器开启30分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定，否则会有变旋光现象。鉴别试验（三）其他鉴别方法TLC、HPLC、制备衍生物测熔点UV、IR★

（四）VitD2、VitD3区别反应：Kober反应：85%浓硫酸—乙醇显色甾类化合物的显色反应VitD2：红色，

max=570nmVitD3：黄色，

max=495nm杂质检查（一）麦角甾醇ChP规定VitD2中必须检查项目试剂：洋地黄皂苷溶液混合放置18小时，不得发生浑浊或沉淀（二）前VitD（5，7—二烯甾醇）的光照产物（三）有关物质：NP-HPLC含量测定方法种类：化学法光谱法色谱法微生物法生化法—竞争蛋白结合法（特异性最高）中国药典——正相高效液相色谱法维生素D的含量测定的高效液相色谱法（ChP方法简介）方法提要：NP-HPLC(VitD2、VitD3均以本法测定)硅胶柱流动相：正己烷—正戊醇（997:3）检测波长:254nm定量方法：内标法，(测定维生素D的总量.)内标物：邻苯二甲酸二甲酯

该法分为三个方法:第一法：用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，直接进样测定：1．系统适用性试验：测定重复性和分离度。

维生素D3

、前维生素D3

、反式维生素D3

、速甾醇D3

（R>1.0)2．测定前维生素D折算维生素D的校正因子：f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）3．含量测定：用维生素D及前维生素D折算维生素D的总量.mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS

第二法：用于有杂质的干扰的情况，需要预处理：1．皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙醚、制备供试液A。2．净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制备成供试液B。3．含量测定：取供试液B按第一法测定。第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况，预处理后还要处理：1．预处理后在经提取分离制备供试液C。供试液C用于进样测定：2．含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样对照液和供试液C，按外标法定量。

维生素E的分析主要生理功能：

1.抗氧化作用：清除自由基保护膜结构。

2.促进血红素的合成：能提高血红素合成过程中的关键酶ALA合成酶和ALA脱水酶的活性OCH3COOR2R1R3生物效价右旋体：消旋体=1.4:10（天然品）（合成品）一、结构及性质★★[结构特点]:1．芳环：具弱紫外吸收，可用于鉴别。2．乙酰化的酚羟基：水解后生成生育酚，可发生三氯化铁反应和氧化还原反应，用于鉴别。分子中无亲水基，不溶于水。酯键易水解

维生素E为苯丙二氢吡喃醇衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基，又称生育酚。α-异构体活性最强。一、结构及性质★[理化性质]:1.溶解性微黄色或黄色透明的粘稠液体，易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，不溶于水。2.水解性：在酸性或碱性溶液中，加热可水解生成游离生育酚。3.易氧化性：维生素E水解后的产物，在有氧或其他氧化剂存在时，则进—被氧化生成醌，碱性条件下加热则更易反应，应避光、避氧保存。4.弱紫外吸收:本品的无水乙醇溶液在284nm波长处测定吸收度时，其吸收系数E1%1cm为41.0—45.0。(0.1mg／mL溶液测定)（此性质可用于鉴别，但不能用于含量测定！）二、鉴别试验★1.硝酸反应ChP，JP★[原理]:维生素E在硝酸酸性溶液中，加热可水解生成生育酚，生育酚继续被氧化成为邻醌结构的生育红。（橙红色）强氧化剂生育酚HNO3（橙红色）生育红[方法]：取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75℃加热约15min，溶液应显鲜红色，逐步转为橙红色。[特点]：简便、快速、呈色明显★2.三氯化铁反应:★[原理]:维生素E在碱性溶液中加热水解生成游离生育酚，并被三氯化铁氧化为对生育醌，同时生成亚铁离子。后者与联吡啶生成血红色的配离子。生育酚[O]对-生育醌弱氧化剂血红色★[方法]：取本品约10ml，加醇制氢氧化钾试液2ml，煮沸5min，放冷，加水4ml与乙醚10ml，振摇、静置使分层，取乙醚液2m1，加2，2’—联吡啶的乙醇溶液(0.5→100)数滴和三氯化铁的乙醇溶液(0.2→100)数滴，应显血红色。[讨论]:1.)测定前必须水解维生素E,操作繁琐2.)专属性不高3.紫外光谱法本品的0.01％(W/V)无水乙醇溶液λmax=284nmλmin=254nm

=41.0～45.5可用于鉴别。4.薄层色谱法硅胶G板溶剂：氯仿展开剂：环己烷—乙醚（4:1）浓硫酸显色，根据Rf值定性

★5.气相色谱法:USP(24)ChP(2000)以保留时间定性6.红外光谱法:JP(14)BP(2000)VitERf

=0.7三、杂质检查1.酸度检查目的:检查维生素E制备过程中引入的游离醋酸.方法:ChP酸度检查法.(教材P275)★

2.特殊杂质——游离生育酚的检查ChP(2000)方法:硫酸铈滴定法.[原理:]游离生育酚有还原性,可被硫酸铈定量氧化.可以用硫酸铈滴定法来控制游离生育酚的限量.[检查方法]

取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈滴定液(0.01mol/L)滴定，消耗硫酸铈滴定液不得超过1.0m1。若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，则应重新计算硫酸铈的消耗量！！[讨论]1.酸性环境中进行,否则硫酸铈滴定液会生成碱式盐而影响测定。2.二苯胺的作用是作为指示剂,终点时溶液由亮黄色转变为灰紫色.3.1mol的硫酸铈相当于1/2mol的游离生育酚(215.4g);每1ml(0.01mol/L)的硫酸铈滴定液相当于0.002154g游离生育酚.4.ChP规定的杂质限量为2.15%.维生素E的分析四、含量测定应该采用何种方法？根据化学性质：1.可被硫酸铈定量氧化.——铈量法2.三氯化铁反应——生成的亚铁离子作用形成有色结合物间接测定（三氯化铁—2，2’—联吡啶比色法）含量测定根据物理化学性质：1.紫外分光光度法:——不适用λmax=284nmE1%1cm=41.0—45.0<100

2.色谱法方法简便快速，专属性强，特别适用于多种维生素制剂中维生素E的测定。

3、荧光分光光度法★★气相色谱法(ChP)六十年代起开始研究维生素E的气相色谱法(GLC).GC特点选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制气相色谱法(GLC)测定维生素E的优点

可分离维生素E、其异构体及杂质，可选择性地测定维生素E

。适宜测定纯度不高的维生素E及维生素E制剂。中国药典测定维生素E及维生素E制剂均采用气相色谱法。VitE测定的色谱条件载气→N2★固定液→50%苯基—甲基硅酮（OV-17）或HP-1柱温→265℃检测器→氢火焰离子化检测器(FID)★内标→正三十二烷内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近系统适用性试验：n≥500（按维生素E计算）

R≥2（维生素E与内标物正三十二烷的分离度

）★定量法:内标法加校正因子1KAA=内对2KAA=内样实际工作中的计算方法本品含C31H52O3应为96.0~102.0%其他药典方法：BP（2000）GC内标正三十二烷R≥1.4USP（24）GC内标十六酸十六醇酯R≥1.0JP（14）HPLC测定dl－α－生育酚[JP（14）中的维生素E]

外标法JP（15）RP-HPLC外标法简介样品、外标→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）流动相→甲醇-水（49：1）检测波长→292nm（吸收峰肩峰）

R＞2.6RSD≤0.8%对样对生育酚HHmW×=维生素E的荧光分光光度法（一）荧光反应法原理：维生素E的硝酸反应。利用硝酸将氧化为生育红，再将这一产物和邻苯二胺在冰醋酸中缩台，缩台物在紫外光照射下发生绿色荧光。以F—C定量。维生素E的荧光分光光度法二、新分析技术的应用——同步扫描直接（内源）荧光法[原理]：维生素大多含有芳香环结构（大的共轭

键结构），本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。如血液中维生素A345nm激发，490nm处测量。维生素E295nm激发，325nm处测量。直接295nm激发，325nm处测量。则溶剂Raman光谱严重干扰测定!(教材图14-6)同步荧光扫描技术（可变角同步扫描技术）90年代Clark等人近年提出的新技术，可以减小了散射光的影响，改善由常规荧光扫描所无法分开的光谱重叠体系的分辨率。分类：1.“固定波长同步扫描荧光测定”——维生素E的荧光法使用2.“固定能量同步扫描荧光测定”

3.“变角同步扫描荧光测定”Stoke位移扫描过程中使激发波长（

ex）和发射波长（

em）彼此间保持固定的波长间隔

em-

ex=常数（本实验中△

为40nm）定量依据:FSL=2.3KCLI0XI0由Fex（

em-

）决定、X由Fem（

em）决定

FSL=2.3KCLI0X由Fex（

em-

）与Fem（

em）的乘积决定

在△

保持固定的情况下，同步荧光的信号强度便与待测物质的浓度成正比

实验确定△的原则:1.能消除或减小溶剂Raman光干扰2.兼顾方法灵敏度3.一般推荐选择等于（或大略于）Stoke位移的△

.优点:有望获得同步荧光信号最强、半高宽度最小的单峰同步荧光光谱。

维生素类药物的分析方法总结★[结构特点与分析方法的关系归纳总结]要求记住六种维生素药物的结构式特征本类药物重要结构特点及反应比较1．共轭多烯结构：具有紫外吸收，（1）可采用紫外吸收光谱法进行鉴别，VitA、B1、C、D、E（2）可采用紫外分光光度法进行含量测定。VitA、B1、C、D本类药物重要结构特点及反应比较2.旋光性：VitC、D具手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。VitC

：＋20.50～＋21.50VitD2：+102.5°～+107.5°VitD3：+105°～+112°

VitE为消旋体VitA、B1无旋光性本类药物重要结构特点及反应比较3.以三氯化锑生成络合物反应：维生素A、D与三氯化锑生成络合物。维生素A：蓝色，渐变紫红维生素D：即橙红色，渐变粉红其他维生素无此反应

还原性引起的反应：4.还原性：

VitA、C、D、E都具有还原性,易被氧化.还原性引起的反应：（1）.三氯化铁反应:VitD、EVitD:橙黄色VitE:水解后以三氯化铁、2，2-联吡啶反应：血红色还原性引起的反应：（2）硝酸反应：VitE溶液应显鲜红色，逐步转为橙红色。（3）硝酸银反应：VitC黑色沉淀（4）2，6—二氯靛酚反应：VitC颜色消失VitC、D、B1的特征反应VitC类似糖类物质：发生糖类的糠醛缩合反应以三氯醋酸、吡咯50℃产生蓝色

VitD类似甾体类物质：发生甾体类的Liberman反应、Kober反应Liberman反应：醋酐-浓硫酸试剂D2：黄红紫绿D3：黄红紫蓝绿绿VitC、D、B1的特征反应Kober反应：85%浓硫酸—乙醇显色VitD2：红色，

max=570nmVitD3：黄色，

max=495nmVitB1类似生物碱类物质：发生生物碱试剂沉淀反应碘化汞钾淡黄色沉淀碘红色沉淀VitC、D、B1的特征反应硅钨酸白色沉淀苦酮酸扇形白色结晶

VitB1为硫杂环类物质：1.发生硫色素反应

:铁氰化钾试液强烈的蓝色荧光，酸化后荧光消失.2.发生硝酸铅反应

:氢氧化钠、硝酸铅黑色沉淀

★★ChP版规定的含量测定方法(一)维生素A★★紫外分光光度法——三点校正法（第一法、第二法）中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。★★ChP规定的含量测定方法(二)维生素D正相高效液相色谱法，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯

用维生素D及前维生素D折算维生素D的总量.中国药典收载的维生素D及其制剂，均用本法测定。★★ChP规定的含量测定方法★★

（三）维生素E气相色谱法(GLC)定量方法为内标法，内标物为正三十二烷。中国药典收载的维生素E及其制剂，均用本法测定。★★ChP规定的含量测定方法★★

（四）维生素C碘量法，碘滴定液滴定1m1的碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6中国药典中维生素C原料、维生素C片、维生素C泡腾片、维生素C注射液、维生素C颗粒剂等进行含量测定均选用此方法★★ChP规定的含量测定方法★★

（五）维生素B1原料药与制剂测定方法不同！原料药测定：非水溶液滴定法高氯酸滴定液滴定，高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定度为16.86mg/ml。制剂测定：紫外分光光度法用盐酸溶液（91000）将维生素B1片粉中的维生素B1溶出，经过滤、稀释后于246nm测定吸收度，计算含量。1．在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水后，加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是

A.氯氮卓

B.维生素AC.普鲁卡因

D.盐酸吗啡

E.维生素C2、中国药典采用以下何法测定维生素E含量

A.酸碱滴定法

B.氧化还原法

C.紫外分光光度法

D.气相色谱法

E.非水滴定法3、中国药典采用气相色谱法测定维生素E含量，内标物质为

A.正二十二烷

B.正二十六烷

C.正三十烷

D.正三十二烷

E.正三十六烷4、维生素C的鉴别反应，可以采用的试剂有

A.碱性酒石酸铜

B.硝酸银

C.碘化铋钾

D.2、6-二氯靛酚

E.三氯醋酸和吡咯5、测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了

A.保持维