新药评价课件

GLPGLP是英文GoodLaboratoryPracticeforNonclinicalSafetyStudies的缩写，根据其内容，可译为药品非临床研究质量规范GLP产生的历史60年代震惊世界的“反应停”事件1972,

1973年，新西兰、丹麦首先进行了GLP立法其它药害事件30年代，美国“磺胺酏剂”

50年代，法国的“有机锡”60年代，日本的“氯碘喹林”等等 GLP产生的历史美国FDA对几个安全性评价研究实验室检查，发现存在许多问题。主要有：实验设计不充分，实施不仔细，分析、报告不准确实验记录不及时、准确，不完整，原始记录及受试样品的保存欠妥当没有实施保证数据可靠的质量保证工作，也没有适当的监督人员GLP产生的历史没有保证研究人员具有资格并按受培训不注意遵守方案的实施，动物饲养管理、数据管理的标准操作规程（SOP）没有充分监督全部或部分合同实验室进行的研究提交报告前，未核对报告中数据的准确性和完整性GLP产生的历史工业生物测试实验室（IBT）和生物统计测试公司的问题最严重FDA检查处理结果：IBT有4人被控犯诈骗罪FDA审查的66个研究项目中有24个无效检查结果促使FDA于1976年11月颁布了GLP法规GLP产生的历史1981，国际经济合作与发展组织（OECD）制定了GLP原则80年代中，日本、韩国、瑞士、瑞典、德国、加拿大、荷兰等国家制定了自己的GLPGLP产生的历史我国GLP起步于90年代初91－93考察美、英、日等国的GLP实验室国内多次专家会研讨93年12月，国家科委发布了＜药品非临床研究质量管理规定＞99年10月，国家药品监督管理局根据国务院赋予的职能，对GLP进行了修改后重新发布GLP制定的目的(1)

提高实验数据质量，避免偶发变动绝对变动人类无法控制的机体及环境本身的变动如季节性、性周期、24h节律、伴随营养成长变动等相对变动实验处置、操作而产生的肌体反应性变动如给药、手术、实验感染、禁食等偶发变动偶发变动、没有规律是引起实验误差的主要原因动物自发感染、试验操作误差、药品调配及记录错误等GLP制定的目的(2)保证原始数据的准确性评估某一商品的质量是凭它的外观、造型、功能及耐受性。而生物实验报告则不同，其实体是原始数据，只有保证原始数据准确的基础上，才能保证生物实验报告的质量GLP制定的目的(3)提高国际间安全性实验数据相互利用率经过近二十年的发展，GLP已成为国际间新药安全性实验研究共同遵循的法规。凡在国际公认的GLP实验室实施的安全性实验，加上采用ICH国际协调一致的指导原则，其数据具有通用性，这样节省了人力、物力及新药开发时间，同时也降低了新药价格GLP涉及的范围范围：在实验室条件下,为评价药品安全性,用实验系统进行的各种毒性试验单次给药的毒性试验反复给药的毒性试验三致试验（生殖毒性、致突变、致癌试验）各种刺激性试验依赖性试验评价药品安全性有关的其它毒性试验GLP为保证数据质量所采措施(1)构成要素的全体保证人－－－－工作人员、组织机构设备－－－设施、设备、仪器材料－－－实验模型、受试物、试剂、饲料、饮用水方法－－－实验方案、SOPGLP为保证数据质量所采措施(2)文书化的保证实验方案、实验实施至实验总结报告的全过程必须以文书的形式记录、实验操作必须以实验方案及SOP为依据，使任意一个实验操作细节都有据可查GLP为保证数据质量所采措施(3)QAU（第三者）确认保证这是GLP主要采取保证实验数据质量的措施。由实验单位的质量保证部门（QAU）和上级有关部门以“第三者”的身份及立场客观地对实验设施、GLP运转状态、实验操作及原始数据进行审查GLP主要内容我国GLP分九章37条。主要内容有:人员素质实验设施标准操作规程(SOP)管理监督人员素质是关键,实验设施是保证,SOP很重要,管理监督不可少工作人员应符条件(1)（一）具备严谨的科学作风和良好的职业道德以及相应的学历，经过专业培训，具备完成所承担的研究工作需要的知识结构、工作经验和业务能力；（二）熟悉本规范的基本内容，严格履行各自职责，熟练掌握并严格执行与所承担工作有关的标准操作规程；（三）研究人员应及时、准确和清楚地进行实验观察记录，对实验中发生的可能影响实验结果的任何情况应及时向专题负责人书面报告；工作人员应符条件(2)（四）研究人员应根据工作岗位的需要着装，遵守个人卫生和健康预防规定,确保供试品、对照品和实验系统不受污染；（五）研究人员应定期进行体检,患有影响研究结果可靠性的疾病者,不得参加研究工作

机构负责人职责(1)（一）全面负责和实施对非临床研究机构的建设和组织管理；（二）建立和保存反映工作人员学历、专业培训及专业工作经历的档案材料；（三）确保具备符合本规范要求的各种设施、设备和实验条件（四）确保有足够数量的合格人员,职责明确，能按本规范的要求开展工作；（五）聘任质量保证部门的负责人，并确保其行使本规范规定的职责；（六）制定主计划表；掌握各项研究工作的进展；机构负责人职责(2)（七）组织制定和修改标准操作规程，并促使工作人员掌握与各自工作有关的标准操作规程；（八）每项研究工作开始前,聘任专题负责人；有必要更换时，应记录更换的原因和时间；（九）审查批准实验方案和总结报告；（十）及时处理质量保证部门的报告,详细记录采取的措施；（十一）确保供试品、对照品的质量和稳定性符合要求；（十二）与协作或委托单位签订书面合同。质量保证部门职责(1)（一）保存非临床研究机构的主计划表、实验方案和总结报告的副本；（二）根据本规范的要求，审核实验方案、实验记录和总结报告；（三）对每项研究实施检查和监督，并根据其内容和持续时间制定审查和检查计划。详细记录检查的内容、存在的问题、采取的措施等,并在记录上签名,保存备查；

质量保证部门职责(2)（四）定期检查动物饲养设施、实验仪器和档案管理；（五）及时向机构负责人和专题负责人报告检查发现的问题,提出解决问题的建议,并写出检查报告；（六）参与标准操作规程的制定，保存标准操作规程的副本。专题负责人职责(1)（一）全面负责该项研究工作的运行管理；（二）制定实验方案，提出修订或补充相应的标准操作规程的建议，分析研究结果，撰写总结报告；（三）严格执行实验方案的规定，若有修改，应经本机构负责人批准；（四）确保参与该项研究的工作人员明确所承担的工作，并掌握相应的标准操作规程；专题负责人职责(2)（五）掌握研究工作的进展；检查各种实验记录，确保其及时、直接、准确和清楚；（六）详细记录实验中出现的意外情况和采取的补救措施；（七）实验结束后,将实验方案、原始资料、应保存的标本、

各种有关记录文件和总结报告等,送资料档案室保存；（八）确保研究工作各环节符合本规范的要求实验设施(1)保持清洁卫生。各类设施应布局合理，防止交叉污染，并根据不同设施的需要调控环境条件

动物饲养设施不同种属动物或不同实验系统的饲养和管理设施；动物的检疫和患病动物的隔离治疗设施；收集和处置试验废弃物的设施；清洗消毒设施；供试品和对照品含有挥发性、放射性和生物危害性等物质时，应设置相应的饲养和管理设施

实验设施(2)动物用品的存放设施

供试品和对照品的处置设施

保管实验方案、各类标本、原始记录、总结报告及有关文件档案的设施

环境调控和管理设施

仪器设备和实验材料(1)

专人负责保管,

定期检查、清洁保养、测试和校正，确保仪器设备性能稳定可靠

对仪器设备的使用、检查、测试、校正及故障修理,应详细记录日期、有关情况及操作人员的姓名

仪器设备和实验材料(2)供试品和对照品的管理应符合下列要求：（一）专人保管，完善的接收、登记和分发手续，正确记录批号、稳定性、含量或浓度、纯度和其它化学特征。对照品为市售商品时,可用其标签或其它标示内容代替有关实验测定；（二）贮存保管条件应适当。贮存的容器应贴有标签,标明品名、缩写名、代号、批号、有效期和贮存条件；仪器设备和实验材料(3)（三）分发过程中应避免污染或变质。分发的供试品和对照品应及时贴上准确的标签,并按批号记录分发、归还的日期和重量；（四）需要将供试品和对照品与介质混合时,应在给药前测定其混合的均匀性,必要时还应定期测定混合物中供试品和对照品的浓度和稳定性。混合物中任一组分有失效期的,应在容器标签上载明，两种以上组分均有失效日期的，以最早的失效日期为准

仪器设备和实验材料(4)试剂和溶液等均应贴有标签,标明品名、浓度、贮存条件、配制日期及有效期等。试验中不得使用变质或过期的试剂和溶液。选用合格的实验动物和饲料动物饲养室内使用的清洁剂、消毒剂及杀虫剂等，不得影响实验结果,并应详细记录其名称、浓度、使用方法及使用的时间等。动物的饲料和饮水应定期检验,确保其符合营养标准,污染因素低于规定限度,检验结果应作为原始资料保存

标准操作规程标准操作规程英文为StandardOperatingProcedures，缩写SOP是记述GLP实验室内常规试验有关的各种工作程序、技术方法及管理措施等的一套具有内部法规性文件标准操作规程目的：使GLP系统内各项工作有章有可循，工作有序，互相衔接，紧密配合，确保试验结果的真实性、完整性和可重复性，出现异常现象时便于查寻原因范围：很广，很细(十四个方面)内容：可操作性强，简单明确，以能使具备专业知识，经过培训的人员能理解和掌握为原则。SOP的管理：编号，编写，审批确认，分发，保管，检查和修改等等SOP涉及内容(1)（一）供试品和对照品的接收、标识、保存、处理、配制、领用及取样分析；（二）动物房和实验室的准备及环境因素的调控；（三）实验设施和仪器设备的维护、保养、校正、使用和管理；（四）计算机系统的操作和管理；

SOP涉及内容(2)

（五）实验动物的运输、检疫、编号及饲养管理；（六）实验动物的观察记录及实验操作；（七）各种实验样品的采集、各种指标的检查和测定等操作技术；（八）濒死或已死亡动物的检查处理；（九）动物的尸检以及组织病理学检查；SOP涉及内容(3)（十）实验标本的采集、编号和检验；（十一）各种实验数据的处理；（十二）工作人员的健康检查制度；（十三）标准操作规程的编辑和管理；（十四）非临床研究机构认为需要制定标准操作规程的其它工作

SOP的制订首先制订编辑和管理SOP的规范根据需要提出需制订的SOP题目指定熟悉业务的工作人员执笔撰写组织有关人员讨论修改确保科学性、准确性和可操作性制订者、审核者、确认者及批准者分别签字SOP的管理严格执行SOP的制订、编辑和管理规范SOP原件交资料档案室保管，复印件分发给有关部门或者人员，并登记备案存档任何人不得私自复印任何一份SOP档案室保存一套SOP原件，QAU保存一套复印件，其他人只保存与自己工作有关的SOP废弃不用的SOP统一烧毁，并通知档案室备案除档案室外，任何人不得保存或复印废弃不用的SOP实验方案(1)

1研究专题的名称或代号及研究目的；2非临床研究机构和委托单位的名称及地址；3专题负责人和参加实验的工作人员姓名；4供试品和对照品的名称、缩写名、代号、批号、有关理化性质及生物特性；5实验系统及选择理由；6实验动物的种、系、数量、年龄、性别、体重范围、来源和等级；7实验动物的识别方法；8实验动物饲养管理的环境条件；实验方案(2)9饲料名称或代号；10实验用的溶媒、乳化剂及其它介质；11供试品和对照品的给药途径、方法、剂量、频率和用药期限及选择的理由；12所用毒性研究指导原则的文件名称；13各种指标的检测频率和方法；14数据统计处理方法；15实验资料的保存地点。总结报告(1)1研究专题的名称或代号及研究目的；2非临床研究机构和委托单位的名称和地址；3研究起止日期；4供试品和对照品的名称、缩写名、代号、

批号、稳定性、含量、浓度、纯度、组分及其它特性；5实验动物的种、系、数量、年龄、性别、体重范围、来源、动物合格证号及发证单位、接收日期和饲养条件；6供试品和对照品的给药途径、剂量、方法、频率和给药期限；总结报告(2)7供试品和对照品的剂量设计依据；8影响研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的异常情况；9各种指标检测的频率和方法；10专题负责人和所有参加工作的人员姓名和承担的工作；11分析数据所用的统计方法；12实验结果和结论；13原始资料和标本的贮存处。

临床前毒理学评价目的意义

新药评价的核心内容之一

目的:确保临床用药安全超过限量、改变应用范围或用药途径

变成毒物

1985--1994,收审新药近四千种,已批准上市

约占50%,而另外50%未被批准上市新药中,有相当一部分就是因毒理学评价没有通过毒—无处不在

1274宋慈指出万物皆毒

美国“化学文摘”登记化学品约有一千万种,美国每年投放市场新化学品约一千五百种左右

1992年联合国环境与发展大会将有毒化学品列为二十一世纪全球七大环境问题之一

药害事件

1935-1937

美国

二硝基酚

减肥

白内障、骨髓抑制,死亡

177人

1937

美国磺胺酏剂

消炎尿毒症、肾衰，死亡107人1954-56法国有机锡抗感染207人视力障碍、其中102人死亡1959-62欧日反应停镇静畸胎，12000多人1966-72日本氯碘喹啉肠道感染万余人失明或下肢瘫痪1937-59美国黄体酮先兆流产男性化,

600多人临床前毒理学评价成功例子

化学物质致癌、反应停致畸、己烯雌酚防流产而使子代女性出现阴道癌

致癌、致畸、生殖及三代生殖试验青霉素严重过敏反应

动物模型—豚鼠

临床前毒理学评价的局限性

新药本身

新药不断地改变着化学结构和药理毒理学特征,不同于已有的老药,因而也往往超出人们原有的知识、经验和评价手段所达到的预测能力

临床前毒理学评价的局限性现有评价手段不能完全适应“新药”评价需要

动物实验缺点

种属差异

数量有限

品种单一

健康模型剂量太大临床前毒理学评价总的要求

找出毒性剂量

确定安全剂量范围

发现毒性反应

毒性靶器官的寻找

毒性的可逆与否

解救措施

确保临床用药安全急性毒性试验目的意义基本内容和要求急性毒性LD50常用计算方法有关问题急性毒性试验

目的意义

了解新药急性毒性强度

计算新药相对毒性参数

为临床毒副反应监护提供参考依据

为长期毒性、蓄积性毒性和特殊毒性试验选择剂量提供依据

其它方面

新药急性毒性的强度

表.化学物质的急性毒性分级标准(WHO,1977)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━毒性分级ig大、小鼠LD50

吸入大、小鼠LC50

涂皮兔LD50

人口服可能的

(mg/kg)(ppm)(mg/kg)致死量(g)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━极毒<1<10<50.06剧毒1-5010-1005-444中等毒51-500101-100045-35030低毒501-50001001-10000351-2180250实际无毒>5000>10000>2180>1200━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━*吸入毒性LC50指中毒栏中的浓度,一次中毒2-4小时,观察24天

新药急性毒性的强度

表.欧共体对化学物的毒性分级━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━动物及给药途径剧毒毒有害━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━大鼠LD50ig(mg/kg)≤2525-200200-2000大鼠或兔经皮LD50(mg/kg)≤5050-400400-2000大鼠LC50(mg/L/4hr)≤0.50.2-22-20━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

相对毒性参数

治疗指数TI=LD50/ED50安全系数SF=LD5/ED95可靠或确实安全系数CSF=LD1/ED99安全范围SM=(LD1/ED99-1)X100%SED50/ED50,越大越安全LD5基本无害量ED95基本有效量LD1肯定无害量

ED99肯定有效量为临床毒副反应监护提供参考

中毒症状起始时间持续时间恢复时间对抗试验为临床急救提供依据

急性毒性试验观察动物反应指标

中毒部位毒性症状表现中枢神经系统

呆滞:对刺激反应迟缓、减弱、消失；不安：对刺激反应过敏、兴奋；强直：对行动姿势改变、叫声异常、震颤、共济失调

植物神经系统瞳孔缩小、放大、分泌增多，如流涎、流泪

呼吸系统鼻孔流鼻涕、呼吸缓慢、困难、潮式呼吸、速率加快等心血管系统心动过速、缓慢、心律不齐、心跳过强、微弱胃肠系统气胀、腹泻、便秘、粪便不成形、粪便黑色生殖系统乳腺膨胀、会阴部污浊、阴囊下垂等皮肤、毛皮肤发红、松弛、皮疹、毛竖起粘膜口腔流粘液、充血、溃疡、出血性紫绀眼睛上睑下垂、眼球突出混浊其他直肠温度升高、降低；消瘦；拒食等

为长毒、蓄毒试验选择剂量提供依据

长期毒性剂量设计LD50法(1/10,1/50,1/100)MTD法(1,1/3,1/10)蓄积性毒性剂量设计1/10LD50,然后按等比级数1.5倍逐渐递增为特殊毒性试验选择剂量提供依据

生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD致突变试验啮齿类动物微核试验高剂量为1/2LD50果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2LD50和1/4LD50精原细胞染色体畸变试验高剂量应为1/2LD50

动物短期致癌试验高剂量应是MTD主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50

其它方面

系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50复方中药物的相互作用,有时也通过拆方及合用的LD50来判别相互作用的性质基本内容和要求---动物啮齿类----小鼠或大鼠非啮齿类----犬或其它一类药至少必须用二种动物(啮齿类及非啮齿类各一种,其中非啮齿类宜用Beagle犬);其它类酌情用二种动物小鼠18-22g,同次体重相差不超过4g;大鼠120-150g,同次体重不超过20g;犬用成年犬♀♂各半

基本内容和要求---给药途径一类药及可溶于水的至少用两种给药途径,其中一种必须是临床给药途径其它类至少有一种临床给药途径实验动物上无法进行时,则作特殊说明,可用别的给药途径基本内容和要求---剂量和分组

小动物一般分4-6个剂量组,组距0.65-0.85,求出LD50大动物可用50%等量递升法,一般用6条犬,求出ALD和MTD

基本内容和要求---给药容积

不等浓度等容量给药常规给药容量为:小鼠ig0.2-0.4ml/10g,ip、sc和iv0.1-0.2ml/10g大鼠ig1-1.5ml/100g,ip、sc和iv为0.5-1ml/100g

基本内容和要求---观察记录

给药当天,尤其是药后4h内应严密观察并记录,然后每天上下午各一次,连续观察7-14天详细记录动物毒性反应情况和死亡情况,中毒症状,中毒发生时间、持续时间、恢复期及动物最短死亡时间、最长死亡时间和平均死亡时间

死亡动物应及时进行尸检,记录病变情况;若肉眼可见变化时则需进行病理检查基本内容和要求---结果处理

实验资料按下表列出,用Bliss法计算LD50。必要时求出不同性别LD50

表.XXX急性毒性结果及LD50计算━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━剂量对数剂量动物数死亡动物数死亡率机率单位LD50及可信限(mg/kg)(X)(只)(只)%(Y)(mg/kg)━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━基本内容和要求---MTD测定

最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50,可只求MTD值。方法：一次给20只动物,连续观察7-14天,未见任何动物死亡,则MTD＞XXg/kg。若仅有个别死亡,则宜写成LD50>XXg/kg。iv要求

pH5-8，速度：大、小鼠

10-20s。ig时空腹,即禁食12-16h左右表.急性毒性试验常用容量和最大容量(ml)

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━给药途径小鼠大鼠豚鼠家兔狗

ig0.2-1.01-41-55-1050-100ip0.2-1.01-32-55-105-15im0.1-0.20.2-0.50.2-0.50.5-12-5iv0.2-0.51-21-53-1035-50sc0.1-0.50.5-10.5-21-33-10━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━*小鼠指20g,大鼠200g,豚鼠200g,兔2.5kg,狗10kg,前者为常用量,后者为最大容量急性毒性LD50常用的统计方法白仑氏法(Behren'smethod)(累计法)密勒和滕特尔二氏法(MillerandTaninter'smethod),也叫目测法、概率法(对数机率单位绘图法,1944年)寇氏法(Karber'smethod),也叫克贝尔法点斜法(孙瑞元孜良寇氏法)改良寇氏法(顾汉颐改进寇氏法)维尔氏法(Weil'smethod),机率单位法Bliss法(Bliss'method)Finney法(改进Bliss法),概率单位加权回归法有关问题---毒理学界对LD50的看法

LD50只是急毒试验结果（信息）的一部分从安全性评价角度来讲，主要是毒性信息，而非精确的LD50LD50测定的不足：动物消耗量大获得信息有限测得数值不准急性毒性研究中应注意的问题（一）

动物品系写清楚、

♀♂各半、体重和鼠龄要符合要求分组应随机

药物浓度、给药容量、给药途径应交待清楚

详细记录中毒情况注意溶媒对照其它毒性试验腔道用药毒性试验眼刺激试验滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验滴鼻剂和吸入剂刺激试验直肠、阴道用药急性毒性试验直肠、阴道用药刺激试验其它毒性试验药物依赖性试验身体依赖性试验自然戒断试验替代试验催促试验诱导试验精神依赖性试验

皮肤给药急性毒性试验

目的:观察短期接触受试物后皮肤的毒性反应动物:家兔、豚鼠或大鼠，♀♂各半，家兔体重２kg,豚鼠300g,大鼠200g左右,给药前24h将动物背部脊柱两侧毛脱掉,去毛范围约相当于体表面积的10%左右,(家兔约150cm2左右,豚鼠、大鼠约40cm2左右）药物：膏剂、液体或粉末。粉末需用赋形剂（如羊毛脂、凡士林等）混匀，以保证受试物与皮肤有良好的接触皮肤给药急性毒性试验剂量：3个，组距0.65－0.85。家兔每组４只，豚鼠或大鼠每组10只并设赋形剂或空白对照组方法：将受试物均匀涂敷于脱毛区，破损皮肤则在脱毛区划破皮肤后再涂敷受试物。24h后去除，每日观察，连续7-14天。观察动物体重、皮肤、毛发、眼睛和粘膜的变化，呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。若有死亡则进行尸检，当有肉眼可见病变，则需进行病检判断：试验结果与对照组比较判断

皮肤给药的长期毒性试验目的：观察经皮渗透产生的异常反应和可逆程度，找到靶器官动物：家兔(2kg,6只/组)，豚鼠(300g，10只/组)或大鼠(200g，10只/组)，♀♂各半。给药前24h动物背部脊柱两侧脱毛，面积同急毒受试物：同急性毒性试验剂量：３个，要求同大鼠口服长毒试验，并设赋形剂或空白对照组，若用受试物剂量超过有效浓度20倍以上，仍未见动物有不良反应或死亡时，则只须设一个高剂量组皮肤给药的长期毒性试验方法：将受试物均匀涂敷,每日一次，每次至少接触６h，临床用药疗程的３倍以上时间连续给药。若出现毒性反应，部分动物应于停药后继续观察１-２周，以确定毒性反应可逆程度检测指标：除每日观察皮肤、临床变化及皮肤病理学检查外，其血液学、血液生化指标和病理学检查项目同大鼠长期毒性试验要求判断：实验结果应写明安全剂量、中毒剂量、中毒表现、中毒靶器官及中毒的可逆程度等皮肤刺激试验目的：观察刺激反应情况动物：首选家兔(2kg左右)，其次为豚鼠(300g左右)。药前24h脱毛，家兔每侧脱约50cm2，豚鼠每侧脱约20cm2受试物：同急性毒性试验方法：≥３只家兔或５只豚鼠，在受试物区、对照区和破损皮肤区（脱毛后），一次或多次将受试物１ml或1g涂于受试物区，赋形剂则涂于对照区。24h后去除。观察1、24、48和72h涂抹部位有无红斑和水肿等，变化的恢复情况和时间皮肤刺激试验多次给药则每日涂抹一次，连续一周，其余均与一次给受试物的方法和要求一致结果评价：每只动物试验结果进行刺激反应评分，计算出平均分值进行刺激强度评价皮肤刺激反应评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

刺激反应

分值━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━红斑:

无红斑

0

勉强可见

1

中度红斑

2

严重红斑

3

紫红色红斑并有焦痂形成

4水肿:

无水肿

0

勉强可见

1

皮肤隆起轮廓清楚

2

水肿隆起约1mm并范围扩大

4━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━皮肤刺激强度评价━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━强度分值━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━无刺激性<0.5

轻度刺激性<2.0

中度刺激性<6.0

强度刺激性>6.0━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━皮肤过敏试验目的:观察免疫系统反应在皮肤上的表现动物：豚鼠♀♂各半(250-300g)。给药前24h背部两侧脱毛，脱毛区每侧约3x3cm2受试物：若受试物是膏剂或液体，直接试验。若为固体粉末，则用水或赋形剂（如羊毛脂、凡士林、橄榄油等）混匀以保证受试物与皮肤良好接触阳性致敏物：2,4-二硝基氯代苯配成1%的致敏浓度和0.1%的激发浓度皮肤过敏试验方法：分受试物组，空白对照组，阳性对照组，每组10只（♀♂各半）1.致敏接触：将受试物0.1-0.2ml(ｇ)涂在左侧脱毛区，持续6h。第７天和第14天，同法各重复一次2.激发接触：末次致敏后14天，将受试物0.1-0.2ml(ｇ)涂于右侧脱毛区，阳性对照用0.1%2,4—二硝基氯代苯，６h后去除，即刻观察，然后于24、48、72h再次观察过敏反应情况结果评价：试验结果按皮肤反应评分标准评分后，根据试验组与对照组豚鼠皮肤反应的差别，按表判断受试物对皮肤过敏反应性质可用致敏率(红斑或水肿的动物例数/受试动物总数)判断致敏强度皮肤过敏反应评分标准皮肤反应分值红斑形成：无红斑０轻度红斑１中度红斑２重度红斑３水肿性红斑４水肿形成：无水肿０轻度水肿１中度水肿２重度水肿３致敏率分类━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━致敏率（%）反应强度━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━０－10弱致敏性

20－30轻度致敏性

40－60中度致敏性

70－80高度致敏性

90－100极度致敏性━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━光敏试验有些受试物皮肤涂抹后遇光照可引起光敏反应若其化学结构或某些组成（包括药物和赋形剂）文献报导有光敏作用者应作光敏试验其化学结构和已知光敏剂相似者也应做光敏试验皮肤给药毒性试验有关问题赋形剂对照组的设立很重要，不能忽略赋形剂对照，更要重视赋形剂的选择，其各种指标、规格等均应符合药用规格方能用若用于各种受损皮肤时，急毒、长毒等毒性试验也宜以模拟破损皮肤进行高剂量的设计应符合制剂工艺要求，宜以剂型允许配制浓度和允许给药容量为宜。不能将外用药厚厚地涂在皮肤上，以增加剂量是不妥的眼刺激试验目的：观察眼睛接触受试物后产生的刺激反应动物：家兔≥４只，体重2－3kg受试物：液体或膏剂均可直接滴入或涂敷剂量：用原液或原膏剂，不必稀释，每只眼睛滴入0.1ml或涂敷0.1g以内方法：滴入或涂敷于动物一侧眼结膜囊内，另一侧作为空白（或赋形剂）对照。给药后使眼睛被动闭合5－10分。记录给药后6、24、48、72h至7天眼的局部反应情况眼刺激试验临床用药超过一周的受试物要进行多次给药刺激试验，连续给药一周以上结果评价：将每只动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应的分值相加，即是一只受试动物眼刺激反应的总积分。把每个受试动物的刺激反应积分的总和除以动物数，就是该受试物对眼刺激性的最后分值，以此判定受试物刺激程度眼刺激试验--角膜评分

无混浊０散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1

半透明区易分辨，虹膜模糊不清2

出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清3

角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认

4

眼刺激试验--虹膜评分

正常０皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应１出血，肉眼可见坏死，对光无反应（或出现其中一种反应）２眼刺激试验--结膜评分Ａ.充血（指睑结膜、球结膜部位）血管正常０血管充血呈鲜红色１血管充血呈深红色，血管不易分辨２弥漫性充血呈紫红色３Ｂ.水肿无水肿０轻微水肿（包括瞬膜）１明显水肿，伴有部分眼睑外翻２水肿至眼睑近半闭合３水肿至眼睑超半闭合４Ｃ.分泌物无分泌物０少量分泌物１分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着２分泌物使整个眼区潮湿或粘着３

眼刺激性评价标准━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━刺激程度积分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━无刺激性０－３轻度刺激性４－８中度刺激性９－１２强度刺激性１３－１６━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验目的：观察一次滴入或吸入后所产生的毒性反应和死亡情况动物：大鼠、豚鼠或家兔。♀♂各半，大鼠、豚鼠体重在250-300g、家兔在2.5kg左右爱试物：液体或粉末剂剂量：３个剂量，组距0.65-0.85为宜。设赋形剂或空白对照组。若大剂量组（超过临床预计用量的50倍以上）未出现死亡情况时，则只须设一个高剂量组滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验方法：大鼠或豚鼠每组10只，家兔每组４只，♀♂各半。滴入或吸入药后，至少接触４小时，给药后即刻观察及7-14天观察动物全身状况、体重、呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化，若出现死亡则病检结果判断：试验结果与对照组比较。如能测出LD50值则按急性毒性试验要求计算滴鼻剂和吸入剂刺激试验目的：观察滴入或吸入后产生的刺激反应动物：同上述急性毒性试验受试物：液体或粉末剂分组：给药组、赋形剂组及空白对照组，每组家兔３只，或大鼠或豚鼠５只方法：将药滴入或喷雾于动物。和粘膜接触至少４h。于24h处死动物，观察有无充血、红肿等现象。若有变化则需进行病检多次给药则每天滴入或吸入一次,连续７天，于末次给药24h后处死动物结果判断：试验结果与对照组比较进行判断直肠、阴道用药急毒试验目的：观察直肠或阴道一次接触受试物后，由吸敷所产生的毒性反应和死亡情况受试物：栓剂、液体或膏剂。剂量：３个，组距0.65-0.85，须设赋形剂或空白对照组方法：家兔每组４只，大鼠每组10只。将受试物置入≥４h。即刻观察7-14天，观察全身状况，体重、呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。若出现死亡时应做病检结果判断：与对照组比较判断。必要时算LD50

直肠、阴道用药刺激试验目的：观察直肠、阴道的刺激反应动物：同上述急性毒性试验受试物：栓剂、液体或膏剂分组：给药组、赋形剂组和空白对照组。每组家兔４只，大鼠６只方法：受试物置入≥４h，24h后处死动物。取出局部直肠或阴道组织。观察有无充血、红肿等现象，若有变化需进行病检直肠、阴道用药刺激试验多次给受试物则一般每日一次，连续７天，于末次给药后24h处死动物并观察结果判断：试验结果与对照组比较判断腔道用药毒性试验要特别注意既要符合剂型要求，又要考虑腔道可给容量身体依赖性试验--自然戒断试验连续给药后突然停药，观察戒断症状，与同类的代表药作对比，判断受试药的依赖性潜力动物：小、大鼠和猴。小鼠体重20-24g，每组≥20只，大鼠体重180-220g，每组≥10只,猴体重3-5kg，每组3～5只，♂♀各半剂量：2～3，须设赋形剂对照和阳性药对照(吗啡，苯巴比妥或巴比妥)。低剂量用ACD；高剂量组依赖性潜力低的药物应选用接近毒性反应的剂量，毒性低的药物选用MTD。药物可采用恒量或剂量递增的方式给予身体依赖性试验--自然戒断试验给药途径：1～2种给药途径，必须有一种与临床用药途径相同给药期限：镇痛药在小、大鼠需给药30天，猴需给药90天；镇静催眠药在小、大鼠需给药60～90天，猴需给药180天。每天上下午各一次身体依赖性试验--自然戒断试验观察指标：镇痛药在停药前24h及停药后48h内每隔4h观察记录外观体征和行为活动、植物神经系统机能变化，并称重。镇静催眠药在停药前一天及停药后的1至2周内每天观察动物的外观体征和行为活动及自发惊厥发生率外观体征和行为活动包括：应激性、神情过敏(猴)、饮食、睡眠、自发运动活动、攻击性、警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥、呼吸、体温、体重植物神经系统机能变化：腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、瞳孔大小身体依赖性试验--自然戒断试验资料记录及整理：①动物应写明种属、性别、生产合格证号、记录体重、实验室温度及湿度②受试物应写明生产批号、配制方法③戒断症状用记分法统计，对检测指标和体重、惊厥发生率等应设计合理的图表显示。实验结果进行统计处理身体依赖性试验--替代试验给予动物代表药(如吗啡、巴比妥或苯巴比妥)产生身体依赖性后，停止给药，替之以受试药，观察记录动物是否发生戒断症状及发作程度动物：参照“自然戒断试验”剂量：参照“自然戒断试验”给药途径：腹腔注射、灌胃或“药掺食”(drugadmixedfood,DAF)法给予代表药使产生身体依赖性，然后停止给代表药，以同样给药方式给予不同剂量的受试药,观察及记录替代期间动物的戒断行为和体重变化身体依赖性试验--替代试验镇痛药的观察期为停止吗啡前24h和停药后48h内，每4h观察一次；镇静催眠药的观察为停止代表药前一天和停药后的1～2周内，每天观察一次采用1～2种给药途径，必须有一种与临床用药途径相同观察指标：参照“自然戒断试验”资料记录与整理：参照“自然戒断试验”身体依赖性试验--催促试验短时期内给予动物大剂量受试药，然后注射受体对抗剂，观察和记录是否出现戒断症状及其程度。此法只适用于有竟争性受体对抗剂的阿片类药物动物：参照“自然戒断试验”剂量：除低剂量组一般采用临床剂量的1至2倍外，余同“自然戒断试验”给药途径：猴的实验应采用与临床给药途径相同；大、小鼠的实验选用二种给药途径，其中必须有一种与临床用药途径相同身体依赖性试验--催促试验给药期限：猴连续给药30～60天，上、下午各一次，大、小鼠连续给药3～5天停药后给予阿片受体对抗剂，常用钠洛酮，亦可用环丙羟丙吗啡。观察给受体对抗剂后1～2h内动物出现的戒断症状及体重变化观察指标：参照“自然戒断试验”。小鼠适应观察记录跳跃次数资料记录及整理：参照“自然戒断试验”身体依赖性试验--诱导试验应用各种诱发惊厥的方法如听源性发作和戊四唑惊厥，对镇静催眠药产生身体依赖性的动物，在断药期间阈下刺激强度就可出现反跳性兴奋，诱发惊厥动物：只有大、小鼠。应预先挑选对各种阈下刺激无惊厥反应鼠剂量：参照“自然戒断试验”，阳性代表药为苯巴比妥或巴比妥身体依赖性试验--诱导试验给药途径：二种，有一种同临床途径给药期限：30天，每天二次，上、下午各一次观察指标：听源性发作实验在停药后的一周内每天记录发作率和体重；戊四唑实验在停药24h后记录一次发作率和体重资料记录及整理：参照“自然戒断试验”精神依赖性试验采用”自身给药“测定iv药物对动物的强化效应动物：200～250g的健康大鼠，♂♀各半剂量：1～2个剂量组，加上一个阳性药对照组(阿片类--盐酸吗啡，镇静催眠--苯巴比妥钠或戊巴比妥钠)，每组10只动物。方法：戊巴比妥钠麻醉下行颈外静脉插管术，将插管一端固定于血管内，另一端与恒速泵及药液输入系统相连。术后第二天开始对大鼠进行自身给药训练，直至动物建立自身给药(踏板)行为目的意义研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤、衰老及畸胎等特殊毒性试验存在着种属差异性定性差异定量差异定性差异反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家狗、３种田鼠和８种灵长类动物不致畸可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致畸硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却引起脸和内脏畸形

定量差异致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显

表人类与动物致畸剂量比较药物最低致畸剂量（/kg/d)人与动物比值人动物反应停0.5-1.0mg兔2.5mg

5-2.5

氨基喋呤50μg大鼠100μg2

氨甲喋呤42μg大鼠200μg4.8

乙烯雌酚20-80μg恒河猴200μg10-2.5

苯妥英钠2mg小鼠50mg25致突变试验

微生物回复试验(Ames试验）+哺乳动物培养细胞基因突变试验+果蝇伴性隐性致死试验染色体畸变试验+啮齿动物显性致死试验+精原细胞染色体畸变试验动物微核试验

+程序外DNA合成(UDS)试验+SOS显色试验微生物回复试验菌株:组胺酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium),采用TA98、100、97、102,检定符合要求,-80℃或液氮冻存备用剂量：由药物对细菌的毒性和溶解度决定最高剂量：a.一般5mg／皿，b.最高溶解度，

c.根据杀菌情况确定最大浓度最低剂量：一般1μg／皿或0.1μg／皿。剂量级：5个以上微生物回复试验代谢活化：加肝脏微粒体酶(S9)和不加S9平行条件下测试对照：阴性、阳性对照和S9对照方法：标准平板法或预培养法，48h观察结果，如菌落太小，可继续培养并延长到72h观察结果。每一浓度至少三皿，实验至少重复一次结果判定：①受试物所诱发的回变菌落数(ｘ±ｓ)增加，超过对照2倍，量--效关系；②某测试点超过对照2倍以上，呈现可重复的并有统计学意义的增加。符合上述任何一条即可判为阳性微生物回复试验如某些药物有明显杀菌作用，可改用哺乳动物细胞基因突变试验如某些阳性或可疑阳性时，可选择哺乳动物培养细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验哺乳动物培养细胞染色体畸变试验细胞:建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL),需定期检查核型和有无支原体等污染。-80℃或液氮冻存剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少３个剂量代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验哺乳动物培养细胞染色体畸变试验药物作用时间:药物和细胞接触非活化组作用24h和48h收获细胞,代谢活化组作用6小时以上标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分别在24h和48h收获细胞对照：空白、溶剂、阳性和Ｓ９对照镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍体以及畸变细胞数和畸变类型哺乳动物培养细胞染色体畸变试验受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相关;CHL系统判定如下:畸变率<5%阴性(-)畸变率>5%可疑(±)畸变率>10%阳性(+)畸变率>20%阳性(++)畸变率>50%阳性(+++)注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验啮齿动物微核试验动物：首选ＮＩＨ小鼠，每组１０只性成熟小鼠，雌雄各半，或至少６只性成熟雄性小鼠给药途径与方法：尽可能和临床拟用途径相同，一般为单次给药或诱导给药，必要时可多次给药骨髓采样时间：通过预试，在12-72h不同时间内，取5个作用点，找出合适采样时间，如无差别一般采用24h采样剂量：≥3个，最高剂量1/2LD50对照组：用溶媒作阴性对照，用已知能诱发微核增加的物质作阳性对照

啮齿动物微核试验标本制作：取骨髓、涂片、Giemsa或丫啶橙荧光染色镜检：每只动物至少计数1000个多染红细胞，Giemsa染色，观察其微核出现的频度及多染红细胞和正常红细胞的比率。丫啶橙荧光染色，则直接观察微核出现的频度判定：1.受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关2.某一测试点微核增加可重复并有统计学意义符合上述一条即可判为阳性

啮齿动物微核试验

注意：1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物，必须用荧光染色以进一步肯定或否定阳性结果2.不易通过骨髓屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核试验进一步研究3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或SOS显色试验生殖毒性试验一般生殖毒性试验致畸敏感期毒性试验围产期毒性试验生殖毒性试验----致畸敏感期毒性试验动物：首选Wistar或SD大鼠，也可用小鼠或家兔Ｉ类最好增加家兔或猪、猴、狗之一动物数：每组孕大、小鼠≥１５只，孕兔≥８只剂量：高、中、低三个剂量，限度剂量为1g/kg。高剂量产生母体毒性，或为最大给药量。摄食量减少，体重增加缓慢或下降,阴道流血、流产等均是毒性反应表现。低剂量无母体和胚胎毒性给药途径：同推荐临床给药途径，但不宜采用腹腔注射，口服制剂除灌胃外，还可在严格测定其消耗量的前提下自由摄取或拌入饲料生殖毒性试验----致畸敏感期毒性试验给药时期：于胚胎器官形成期连续给药，大鼠孕后6-15天，小鼠6-15天，家兔6-18天对照：必须设溶剂对照。必要时设阳性对照

观察和检查：查到精子或阴栓作为妊娠零天，记录实验动物症状，大鼠于0、3、7、10、13、16、20天称量体重，２０天处死，记录孕鼠重、黄体数、死胎数（着床数、吸收胎、早期死胎、晚期死胎）、活胎数、活胎重、性别、外观异常等。约1/2胎仔固定于Bouin氏液，作内脏检查，另1/2固定于95%洒精作骨骼畸形检查生殖毒性试验----致畸敏感期毒性试验报告：将数据列成表，提供药物对孕期和胚胎的影响，包括孕鼠数及体重变化，黄体总数及均数，活胎总数及均数，活胎重，性别，死胎总数及着床数，吸收胎，早期和晚期死胎等；药物对胎仔各器官的影响，包括在外观和内部检查中发现的各种畸形；药物对胎仔骨骼发育的影响，包括头颅骨、胸骨、前、后肢骨和其它骨骼的骨化程度，变异和畸形等判定：各项数据经统计处理后判定药物的胚胎毒性和致畸潜力

致癌试验短期致癌试验哺乳动物培养细胞恶性转化试验小鼠肺肿瘤诱发短期试验长期致癌试验致癌试验

哺乳动物培养细胞恶性转化试验(短期)剂量：≥3组，高剂量一般以抑制50%集落生长浓度为基准药物接触时间：药品一般和细胞接触24h，然后再培养7-14天代谢活化：应说明外源性代谢活化系统对照：空白、溶媒、阴性和阳性对照观察报告：将细胞固定、染色、分别计算每皿集落数，转化集落数，转化频度＝转化集落数/106存活细胞，转化率＝转化集落数/总集落数致癌试验

哺乳动物培养细胞恶性转化试验(短期)判定：1.有明确量效关系；2.若无量效关系，但在≥２个浓度中发生细胞转化；3.在单一剂量下出现≥３个转化集落时符合上述一条件者可判为阳性，否则为阴性。如判定有困难时，应进一步对细胞进行核型分析，软琼脂接种等观察判定，必要时可做动物接种生瘤试验

长期致癌试验动物：幼年小、大鼠，♀♂各半。每组１００只剂量：≥３个，低剂量１-３ACD，其余剂量可根据药理毒理作用等因素综合考虑对照：空白、溶媒或赋形剂对照。实验期限：大鼠２年，小鼠1.5年。给药途径：同临床拟用途径观察与检查：观察记录一般情况，肉眼观察到肿瘤病变时，取各器官系统做病检评定：根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等做出全面的科学评价有关问题特殊毒性研究必须加强简、快、灵、准

正确理解审批办法对特殊毒理学研究要求规定一、二类新药必需完成特殊毒理学研究致突变试验必须做Ames‘试验、染色体畸变试验和微核试验有关问题生殖毒性试验致畸敏感期试验(-),

一般生殖毒性(x)，围产期生殖毒性试验(x)避孕药、性激素和致突变试验阳性或有细胞毒作用新药才报送致癌试验受试品或其代谢产物与已知致癌物结构相似受试品长期毒性试验中发现有细胞毒作用或某些脏器、组织细胞异常显著活跃受试品致突变试验结果为阳性报送致癌试验资料，先做短期，阴性者不必做长期有关问题受试物配制样品难溶于水或其它溶剂，不能注射给药时，可改为灌胃。口服给药尽量研磨均匀，必要时制成混悬液。对细菌或细胞试验时，则可以将样品充分研磨均匀，用水或其它合适的溶剂充分浸取灭菌后使用。剂量设计剂量设计与急性毒性的LD50值有关。但少数低毒西药和许多基因工程产品，往往测不出LD50值，只能测MTD；也有少数药品制备困难和价格昂贵，此时允许用多少倍ACD或MTD来表示。细胞染色体畸变试验，毒性很低不能测出50%细胞生长抑制浓度时，其最高浓度以不超过10mM为宜

目的意义

毒性剂量安全范围毒性反应:性质、程度、量毒关系、产生时间，达峰时间,

持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性

毒性反应靶器官毒性反应是否可逆基本内容和要求

----动物二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬(Ⅰ类药Beagle犬，其它杂种犬),必要时用猴动物应写明供应单位及邮编，品系及生产合格证号(杂种犬例外)大鼠6-8周龄，体重差异不超过平均体重的20％。3个月以上可选5-6周龄大鼠Beagle犬4-12月龄，杂种犬龄＜5年♂♀各半

基本内容和要求

----饲养管理饲料写明供应单位，自配应提供配方及成分含量的检测报告动物室温度、湿度、光照和通风条件应达标笼养大鼠每笼≤5只，♂♀分开，有条件时单笼饲养,实验前适应≥1周,食量每天记录，体重每周称一次。犬宜单笼饲养，定量喂食，Beagle犬实验前至少训养1-2周，标准饲料喂养。杂种犬要预先检疫、驱虫，实验前至少训养1月

基本内容和要求

----受试药写明药名、批号、来源、规格、纯度、理化特性、保存条件及配制方法。溶媒或其他赋形剂注明规格、来源、纯度、批号应符合临床试用质量标准，最好和药效、一般药理、急性毒性、药代动力学研究用药有相同质量标准

基本内容和要求

----给药途径与临床给药途径一致混入饲料或饮水中灌服时保证受试药分布均匀在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定计量准确临床iv时大鼠可用ip代替，im或sc可变换注射部位基本内容和要求

----剂量及分组三个给药组(大动物可二个组),单位:mg(ml,IU)/kg或/m2以不等浓度等容量给药低剂量组--高于有效剂量，不出现毒性反应中剂量组--产生轻微或中等度毒性反应高剂量组--产生明显或严重的毒性反应，或个别动物死亡空白对照--溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组基本内容和要求

----剂量及分组<3月，大鼠♂♀各10只/组≥3月，大鼠♂♀各20只/组大动物大剂量组♂♀各3只

,其余♂♀各2只/组限度试验：如小鼠ig急毒>5g/Kg,iv>2g/Kg仍无毒性反应和死亡或仅个别有毒性反应,可只做一个>50ACD(犬用30ACD)的剂量组

基本内容和要求

----给药周期

表.临床与动物给药对应周期

临床给药周期动物给药周期

1～3天14天

1周1月

4周3月≥1月6月≥3月可一周6天给药,周日休息,每天给药时间相同

基本内容和要求

----检测指标

一般观察

外观体征和行为活动(NS兴奋或抑制，肌肉麻痹或震颤，步态异常等),皮毛贴身或稀疏竖散,粪便性状、颜色、食量及体重变化大动物应增加瞳孔、肛温、呼吸、呕吐、流涎、尿、皮肤粘膜(充血、紫绀、苍白)、眼、鼻、外阴部分泌物等,发现死亡或濒死动物应1小时内及时尸检基本内容和要求

----检测指标

血液学指标

红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞压积（Hct）、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板（Plat）计数、白细胞（WBC）计数及分类（淋巴细胞和粒细胞）、凝血时间（CT），必要时进行网织红细胞计数基本内容和要求

----检测指标

血液生化指标

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（Tbill）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、血葡萄糖（Glu）、总胆固醇（Tch）

必要时增加相应的血液生化指标大动物要做尿液检查:亚硝酸盐、pH、蛋白质、尿RBC、葡萄糖、酮体、胆红素、尿胆原、尿比重、尿WBC

基本内容和要求

----检测指标

病检器官

脏器系数：心、肝、脾