DB36-T 1903-2023 实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

ICS

65.020.30CCS

B

44

DB36江 西 省 地 方 标 准DB36/T

实验动物

小鼠肝炎病毒荧光定量

PCR

检测方法Laboratory

animal—real-time

quantitative

method

for

of

virus 江西省市场监督管理局 发

布DB36/T

1903—2023 前言

.............................................................................

II1

范围

..............................................................................

12

规范性引用文件

....................................................................

13

术语和定义

........................................................................

14

缩略语

............................................................................

25

设备和材料

........................................................................

26

试剂

..............................................................................

27

检测流程

..........................................................................

28

结果判定

..........................................................................

4附录

溶液配制方法....................................................

5附录

荧光定量

的引物与探针........................................

6附录

荧光定量

检测方法............................................

7参

考

文

献

..........................................................................

8IDB36/T

1903—2023 本文件按照

GB/T

1.1-2020《标准化工作导则

第

1

草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：贾菠、周银平、张陆兵、谢金明、万筱荣、熊莉娟、肖芳平、罗勇兵、刘欢、周剑、李银才。IIDB36/T

1903—2023实验动物

小鼠肝炎病毒荧光定量

PCR

检测方法1 范围本文件规定了实验动物小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠肝炎病毒的检测，饲养环境中小鼠肝炎病毒的检测参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，本文件。GB/T

分析实验室用水规格和试验方法GB

实验动物

微生物、寄生虫学等级及监测GB

实验室

生物安全通用要求GB/T

转基因产品检测

实验室技术要求GB/T

实验动物

安乐死指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1小鼠肝炎病毒

mouse

hepatitis

virus直径为80nm~160nm的球形RNA病毒之一，小鼠肝炎为小鼠肝炎病毒感染所致。3.2荧光定量聚合酶链式反应

real-time

quantitative

polymerase

chain

reaction;

real-time

在常规PCR个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'PCR反应的循环进行，PCR系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.3Ct

值

cycle

1DB36/T

1903—2023荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸

acid)cDNA：互补脱氧核糖核酸

(complementary

DNA)PBS：磷酸盐缓冲液

buffered

RNase：核糖核酸酶（）Taq酶：Taq

DNA聚合酶

DNA

DEPC：焦炭酸二乙酯

pyrocarbonate)5 设备和材料5.1 设备PCR仪、PCR4℃、0.2

μL、2

、20

μL~200

、100

μL~1000

）。5.2 材料无0.2

、1.5

、5

、15

PCR剪刀、无菌镊子、灭菌棉拭子等。6 试剂6.1

本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合

GB/T

6682

的要求。6.2

灭菌

PBS

A

中的

）。6.3

DEPC

水（配制方法见附录

A

中的

）。6.4

Trizol

裂解液：或其他等效裂解液。6.5

三氯甲烷。6.6

异丙醇：预冷。6.7

75%

A

中的

）。6.8

RNA

逆转录试剂盒：商品化逆转录试剂盒。6.9

荧光定量

PCR

试剂盒：商品化荧光定量

PCR

试剂盒。6.10

引物和探针（见附录

B

中的

）。6.11

阳性对照：小鼠肝炎病毒阳性

片段。6.12

阴性对照：小鼠肝炎病毒阴性

片段。7 检测流程7.1 生物安全要求2DB36/T

1903—2023实验操作及处理按照

GB

19489

GB/T

19495.2

中的要求执行。采样参照

GB

14922

中的要求执行。7.2 样本采集7.2.1 脏器组织按照GB/T

g于15

无酶离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 粪便/盲肠内容物

g于15

无RNA7.2.3实验动物垫料取实验动物垫料1.0g于15

无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.3 样本处理7.3.1 脏器组织在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入4

灭菌

PBS2

，反复冻融

3

次，然后将组织悬液在

，3000

g

离心

10

，取上清液转入另一

5

无

RNA

酶离心管中，编号备用。7.3.2粪便/盲肠内容物在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入4

灭菌PBS溶液，使用电动匀浆器充分匀浆2

，12000

g离心10

，取上清液转入另一5

无RNA酶离心管中，编号备用。7.3.3 实验动物垫料在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入

4

灭菌

PBS

PBS

溶液的量，饲料和垫料需全部浸泡于液体中），静置

30

，取上清液转入另一

5

无

备用。7.4 样本存放采集或处理的样本在

2

℃～8

24

h

℃冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本

提取7.5.1 样本

RNA

在实验室中提取步骤如下：a) 为防止

降解，所用试验用具及溶液应无

酶，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套；b)取

200

μL

已处理好的样品加入到无

RNA

酶的

μL

Trizol

旋涡振荡器剧烈振荡

15s

后，室温放置

；，，c) 加入200

μL

4℃

12000

g离心，，d) 吸取上清液转移至一个新的无

酶的

离心管中，加入

500

μL

异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置

；3DB36/T

1903—2023e) 4℃，12000

g

离心

，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除；f) 加入

1000

μL

预冷的

75％乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀；g) 4℃，

离心

，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀

；h) 加入

μL

DEPC

。提取的

RNA

应在

2h

内使用或﹣80℃冰箱保存备用。7.5.2 样本

RNA

也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6 样本

cDNA反应体系的配制应在冰上操作。

4

、MgCl(25

4

、Oligo

Primer

)0.5

μL、Random

(500

μg/mL

)

0.5

、PCR

Mix

1

0.4

、反转录酶

1

、RNA

1

，用无

RNA

酶水补足反应体积至

，置于

PCR

仪中进行逆转录反应，以

40℃

、70℃

的程序进行一个循环。制备好的

PCR

应保存于℃冰箱。也可选用其它等效逆转录试剂盒进行逆转录反应。7.7 荧光定量

荧光定量PCR检测应符合附录C。8 结果判定8.1质控标准阳性对照

Ct

值≤35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无

Ct

值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定符合

Ct

值≤

Ct

值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本

＜Ct

值≤40

时，重复一次，如果

Ct

值仍然≤40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。4DB36/T

1903—2023AA附 录 A（规范性附录）溶液配制方法A.1 灭菌

溶液NaCl）8.00

g）0.20

gPO）0.24

g钠（NaHPO·O）3.65

g

至

7.2~

1000

。在

103.4

（℃）条件下灭菌

，冷却备用。A.2 DEPC

水（无

取超纯水

）

103.4

kPa（121灭菌，冷却备用。A.375%乙醇取无水乙醇75

，加入25

无RNA酶超纯水，现配现用。5DB36/T

1903—2023BB附 录 B（规范性附录）荧光定量

B.1 引物与探针序列正向引物 5’-GGAACTTCTCGTTGGGCATTATACT-3’反向引物 探针 注：探针可选用具有与和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。6反应组分用量终浓度Probe

qPCR

Mix（210μL1×正向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L反向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L探针（10μmol/L）0.8μL400nmol/LcDNA

模板2μL-灭菌去离子水5.6μL-总体积20μL-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。步骤温度时间釆集荧光信号循环数预变性95℃30s-1变性95℃5s-40退火，延伸60℃34s是注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T

1903—2023CC附录 C（规范性附录）荧光定量

C.1 荧光定量PCR反应体系炎病毒的组织或细胞培养物提取的

RNA

cDNA

病毒的

cDNA

空白对照。表C.1 每个荧光定量

反应体系C.2 荧光定量PCR反应条件表C.2 荧光定量

反应条件7DB36/T

1903—