SN-T4547-2017商品化试剂盒检测方法大肠菌群和大肠杆菌方法一

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准代替SN/T1896—2007商品化试剂盒检测方法大肠菌群和大肠杆菌方法一2017-05-12发布国家质量监督检验检疫总局ISN/T4547—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1896—2007《食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法Petrifilm¹M测试片法》。与SN/T1896—2007相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：——修改了标准的中英文名称；——修改了附录A;——增加了计算公式；——删除了第二法PetrifilmTM测试片MPN法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、大连启元科技发展有限公司。本标准起草人：刘淑艳、颜怀玉、王刚、丁健、尹琪、蒋丹、孙晓飞、周振亚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：1商品化试剂盒检测方法大肠菌群和大肠杆菌方法一1范围本标准规定了食品中大肠杆菌/大肠菌群检验测试片(Petrifilm'ME.coli/ColiformCountPlate)的检测方法。本标准适用于食品和原料中大肠菌群和大肠杆菌的计数。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测。所有培养物和废弃物的处理应按照GB19489有关规定执行。4技术概要大肠杆菌/大肠菌群检验测试片法是用一种预先制备的含有指示剂及冷水可溶性凝胶的培养基系统进行微生物培养的方法。大肠杆菌/大肠菌群测试片含有VRB(VioletRedBile)培养基和β-葡萄糖苷酸酶指示剂，大肠杆菌产生的β-葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应，显示为蓝色并带有气泡的特征菌落；大肠菌群细菌发酵乳糖产酸产气，与pH指示剂反应显示为红色并带有气泡的特征菌落。5设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.2电子天平：感量0.1g。5.3均质器(旋刀式或拍击式)或等效的设备。5.4pH计或精密pH试纸。5.5测试片压板。5.6放大镜或/和菌落计数器。6培养基和试剂6.1无菌生理盐水：见附录A的A.1。26.2磷酸盐缓冲液：见附录A的A.2。6.5大肠杆菌/大肠菌群测试片。本标准使用的试剂盒由美国3M有限公司生产，参考SN/T2775-2011和SN/T3266—2012,由国家认监委商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录B。测试片储存于2℃~8℃,有效期18个月。检测程序见图1。检样检样25g(mL)样品+225mL稀释液10倍梯度稀释选取2个～3个适宜连续稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入大肠杆菌/大肠菌群测试片计数蓝色带气泡和红色带气泡的菌落报告大肠杆菌数报告大肠菌群数计数蓝色带气泡的菌落图1大肠菌群和大肠杆菌测试片计数法检测程序8操作步骤8.1样品制备8.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min,制成1:10的样品匀液。8.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。样品匀液的pH值应为6.5～7.5,pH值过低或过高时可分别采用1mol/LNaOH调节或1mol/LHCl予以调节。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。8.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管，使其混合均匀，制成3SN/T4547—20171:100的样品匀液。8.1.4按8.1.3操作程序，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。8.2样品匀液的接种和培养根据对样品的污染状况的估计及相关限量要求，选取2个～3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2张测试片。同时，分别吸取1mL磷酸盐缓冲液或生理盐水加入两张测试片内作为空白对照。8.3接种将大肠杆菌/大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1mL样品匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，把压板(平面底朝下)放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上。拿起压板，静置至少1min以使培养将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，培养温度为36℃±1℃。大肠菌群检测时培养时间为24h±2h;大肠杆菌检测时，如果是肉、家禽或水产品培养时间为24h±2h,9结果计算与报告9.1.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的大肠菌群或大肠杆菌菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。9.1.2在大肠杆菌/大肠菌群测试片上，蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌。蓝色有气泡和红色有气泡的菌落数之和为大肠菌群数。测试片圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不做计数。出现大量气泡形9.2菌落计数与报告9.2.1选取菌落数在15CFU～150CFU之间的测试片计数大肠菌群或大肠杆菌菌落总数。低于15CFU的测试片记录具体菌落数，大于150CFU的记录为多不可计。每个稀释度的大肠菌群或大肠杆菌菌落数应采用两个测试片的平均数。9.2.2若只有一个稀释度的测试片的菌落数在适宜计数范围内，计算两个测试片大肠菌群或大肠杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(或每毫升)样品中大肠菌群或大肠杆菌菌落总数结果。9.2.3若有两个连续稀释度的测试片菌落数在适宜N——样品中大肠菌群/大肠杆菌总数；Za——测试片(含适宜范围菌落数的测试片)大肠菌群或大肠杆菌菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)测试片个数；4n₂-—第二稀释度(高稀释倍数)测试片个数；d——稀释因子(第一稀释度)。9.2.4若所有稀释度测试片上的菌落数都小于15CFU,则应按稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9.2.5若所有稀释度(包括液体样品原液)的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。9.2.6若所有稀释度的测试片菌落数均不在15CFU～150CFU之间，其中一部分小于15CFU或大于150CFU时，则以最接近15CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。计数菌落数大于150CFU的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估算的菌落数(圆形生长面积为20cm²)。2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.3.4称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。5(规范性附录)培养基和试剂A.1无菌生理盐水A.1.1成分氯化钠蒸馏水称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.2磷酸盐缓冲液A.2.1成分蒸馏水500mLpH7.2A.2.2制法贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱中。稀释液：取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至100mL,分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。NaOH蒸馏水A.3.2制法称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.4.1成分蒸馏水6A.4.2制法移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。7SN/T4547—2017食品种类食品基质检测项目log值范围T检验值参考方法*测试片法肉制品猪肉馅大肠菌群1.00～2.041.00～2.230.096大肠杆菌1.00～1.38<1.000.816牛肉馅大肠菌群1.58～2.822.08～2.890.546大肠杆菌1.00～1.340.816家禽类鸡心大肠菌群2.72～3.112.51～3.000.659大肠杆菌2.46～2.702.26～2.620.590烤鸭大肠菌群1.00～3.461.00～3.320.033大肠杆菌<1.00<1.00结果一致鱼与海产制品多春鱼大肠菌群<1.00<1.00结果一致大肠杆菌<1.00<1.00结果一致墨斗鱼大肠菌群1.00～1.401.00～1.150.478大肠杆菌<1.00<1.00结果一致乳制品酸奶大肠菌群<1.00<1.00结果一致大肠杆菌<1.00<1.00结果一致酪乳粉大肠菌群<1.00<1.00结果一致大肠杆菌<1.00<1.00结果一致杂品花椒大肠菌群2.63～3.652.00～3.610.665大肠杆菌1.00～2.231.00～2.280.023小米面大肠菌群3.15～3.523.38～3.74大肠杆菌<1.00<1.00结果一致·大肠菌群参考方法为GB4789.3—2010的第二法，大肠杆菌参考方法为GB4789.38—2012的第二法。表B.2给出了5种食品线性方程和相关系数。1)本评价结果仅适用于3M公司生产的3MPetrifilm¹“大肠杆菌/大肠菌群检验测试片(3MPetrifilmMAerobicCountPlate)。8表B.25种食品线性方程和相关系数食品种类(代表基体)类别log值范围线性方程相关系数(R²)杂品(麦片)大肠菌群y=0.9121x+0.29780.9775大肠杆菌y=0.7873x+0.29850.8042乳制品(奶粉)大肠菌群y=0.9879x-0.03680.9210大肠杆菌y=0.8715x+0.740.7400鱼类和海产品(多春鱼)大肠菌群y=0.8676x+0.40190.9571大肠杆菌y=1.0949x-0.12930.9329家禽类(鸡肉)大肠菌群y=1.0073x-0.01960.9719大肠杆菌y==0.9959x+0.12060.9543肉制品(火腿)大肠菌群y=1.0635x-0.26790.9912大肠杆菌y=0.952x+0.34010.9123所有食品大肠菌群y=0.969x+0.07050.9525大肠杆菌y=0.9421x+0.32840.8209y——测试片法菌落数的对数值；x——参考法菌落数的对数值。B.2耐变性选用两个污染水平的大肠埃希氏菌(ATCC-25922)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(CGMCC1.1736)和阪崎肠杆菌(ATCC29544),分别进行培养温度和培养时间两个变量的耐变性实验，经验证培养温度选择35℃和37℃,培养时间选择18h和24h条件下对检测结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别，表明说明书中对培养温度36℃±1℃和培养时间24h±2h。统计分析结果见表B.3耐变性统计分析结果实验条件菌株添加水平测试结果平均值标准偏差肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种大肠杆菌阪崎肠杆菌21212高浓度低浓度高浓度低