昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准团体标准

1昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准本标准规定了昆虫抗菌肽的分离纯化技术要求，本标准以家蝇作为材料提纯血淋巴的抗菌肽。本标准适用于以家蝇为材料的抗菌肽分离纯化，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。本规程规定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS电泳、抗菌肽活性测定方法等技术要求。本规程适用于抗菌肽的快速分离。2规范性引用文件用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》GB/T6682-2016《分析实验室用水规格和试验方法》GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定3术语下列术语和定义适用于本文件：3.1抗菌肽（antimicrobialpeptides）抗菌肽（antimicrobialpeptide，AMPs）是一种基因编码的、在体内诱导的、具有抗菌活性的碱性多肽物质，强碱性、热稳定性、对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性。某些抗菌肽还具有抑杀肿瘤、中和内毒素、促进伤口愈合、调节免疫等多种生物学功能。3.2家蝇（Muscadomestica）在25℃,相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。3.3多肽（polypeptides）介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。23.4多肽活力（antimicrobialactivity）抑制微生物的能力，以抑菌圈直径（mm）来表示。3.5热处理（HeatTreatment）抗菌肽是一种弱碱性物质，具有热稳定性、耐低温的特性。将家蝇血淋巴于沸水浴中搅拌加热3min后，迅速在冰浴中冷却，10,000r.p.m/min离心20min，除去变性蛋白，沉淀再用等体积蒸馏水洗2次，以同样转速离心20min，合并3次上清液。3.6超滤膜（ultrafiltrationmembrane）膜超滤方法经常在分离纯化的初期被用来进行蛋白质样品的富集和粗级的分离。该方法的关键是选择不同类型和规格的膜。3.7高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC）高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。4试剂或材料除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用水GB/T6682规定的水。4.1生理盐水0.85%生理盐水：称取8.5g氯化钠，用一级水溶解并定容至1000mL.121℃高压灭菌20min。4.2培养基LB（Lucia-Bertani）液体培养基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，ddH2O定容至200mL，混匀，于高压灭菌锅120℃灭菌20min。LB固体培养基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，2g琼脂粉，ddH2O定容至200mL，混匀，于高压灭菌锅120℃灭菌20min。PDA（PotatoDextroseAgar）培养基：200g去皮土豆，于ddH2O中煮沸30min，纱布（8层）过滤固体残渣，后加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，继续煮沸至完全溶解，用一级水溶解并定容至1000mL，于高压灭菌锅120℃灭菌20min。4.3菌株革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（S.aureus）革兰氏阴性菌：大肠杆菌（E.coliK12D31）34.4Tricine-SDS-APGE49.5%T，3%C：48g丙烯酰胺，1.5g双丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；49.5%T，6%C：46.5g丙烯酰胺，3g双丙烯酰胺，用ddH2O定容至100mL；电泳缓冲液：3.0MTris，0.3%SDS，pH8.25；阳极buffer：200mMTris，pH8.9；阴极buffer：100mMTricine，100mMTris，0.1%SDS，pH8.25；Loadingbuffer(2×)：3ml3MTris(pH8.25)，3mL80%甘油，0.8gSDS；1.5mg考马斯亮蓝R-250，0.5mg苯酚红，加ddH2O定容至10ml；3MTris缓冲液(pH8.45)，36.3gTris碱，溶于80mLddH2O，用浓HCl调pH至8.45，定容至100mL。5仪器设备恒温培养箱：温度精度1℃电子天平：感温为0.0001g和0.01g酶标仪（Bio-rad公司)：波长范围190nm~900nm抑菌圈测量仪：精度0.02mm~0.1mm血球计数板：16格×25格或25格×16格玻璃器皿：直径为90mm，底部平整Bio-rad垂直电泳仪器高效液相色谱仪(P680四元梯度泵、ASI-100自动进样器、PDA-100检测器及Chromleon6.4工作站)KromasilC18色谱柱（250×4.6mm，5um，300A）。6实验步骤6.1家蝇饲养在25℃,相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉,每日更换饮水。幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。6.2家蝇抗菌肽的诱导家蝇3龄幼虫经0.85%生理盐水洗涤，75%酒精消毒后，用微量注射器注射对数生长期的E.coliK12D31（浓度约为108个/mL）2μL/每头，在高温消毒的培养皿中饲养。46.3家蝇三龄幼虫血淋巴的提取及检测每次约20g三龄幼虫，放入到预冷的研钵中，加入0.05M乙酸铵缓冲液5mL，并加入少许(0.1g)苯基硫脲，把虫体剪碎、匀浆，用双层纱布过滤，取滤液在10,000r.p.m/min离心20min，上清液通过纱布除去少量脂肪。再用5mL缓冲液冲洗残渣，混匀，再用10,000r.p.m/min离心20min，取上清。然后合并2次上清，置于-80℃保存备用(参考附录A)。6.4热变性将上述方法所得血淋巴于沸水浴中搅拌加热10min后，迅速在冰浴中冷却，12,000r.p.m/min离心20min，除去变性蛋白，沉淀再用等体积蒸馏水洗2次，以同样转速离心20min，合并3次上清液。6.5超滤膜上清分别用截留10kDa的超滤离心柱10,000g超滤离心10min，收集滤过部分，然后用截留3kDa的超滤离心柱10,000g超滤离心10min，弃滤过部分，收集未滤过部分。Bradford法检测10kDa超滤样品的蛋白浓度，超滤前水解原液浓度为1.12mg/ml，超滤后截留液浓度为1.85mg/ml，滤过液浓度为0.48mg/ml，表明上层样品得到了浓缩，小分子蛋白、无机盐和水等在离心压力下穿过小孔径的滤膜，进入到超滤装置的下层(参考附录D)。6.6蛋白浓度的测定取10mg牛血清白蛋白，用ddH2O溶解并定容到100mL，其终浓度为100μg/mL。称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解至50mL95%的乙醇中，加85%的磷酸100mL，用ddH2O定容至1000mL。按照附录B配制标准曲线溶液(参考附录B)。6.7HPLC经超滤收集到的液体用0.1M的乙酸钠透析过夜，直接上样预先经乙酸钠（pH5.0，0.1M）平衡的CM-SepharoseCL-6B柱，然后以150mL平衡液对150mL，pH5.01M的乙酸钠缓冲液作梯度展开，梯度结束后，再用300mL，1MNaAc（pH5.0）洗脱，流速为0.2mL/min，每1min收集一管，收集合并各活性峰，收集的蛋白冷冻干燥，-80℃保存(参考附录C)。6.8Tricine电泳检测(Tricine-SDS)制胶采用Bio-rad垂直电泳附件模具，制成0.75mm厚凝胶，分离胶分别制成20%T，6%C和15%T，3%C的梯度胶，堆积胶为8%T，3%C。恒电压60v，1h后90v跑至胶尽头。电泳完毕，胶置于0.25%考马斯亮蓝R250的甲醇∶水∶冰乙酸(5∶5∶1)染色液过夜。胶置含12.5%异丙醇10%醋酸中扩散脱色直至背景清晰。并利用CN-UV/WLImage-FormationSystem的Bioplot软件对目的蛋白进行分析，测定该蛋白在总蛋白中的含量，即为其表达率(参考附录D)。56.9平板打孔穴抑菌法6.9.1菌液活化分别挑取平板上的E.coliK12D31和S.aureus单菌落接种于2mLLB培养液中，37℃过夜培养。取此培养液按1/100体积接种于新鲜的LB培养液中，37℃200rpm剧烈振荡培养至OD600=0.3。6.9.2指示菌液制备按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数。建立菌落计数与OD600的关系，调整至菌落数为5~1*106CFU/mL6.9.3制备平板取LB固体培养基约20ml，加热融化后冷却至45℃左右，加入60μl的工程细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，OD600=0.3)，摇匀，倒入9厘米玻璃培养皿。6.9.4测定用一打孔器(孔径约3mm)沾取酒精经火焰灭菌3次，在已含菌的平板上打孔，每孔加样20μl纯化的小肽，点样后的平皿放入5℃冰箱培养12h让抗菌肽充分扩散到琼脂中以得到更大的抑菌效果，同时还可以抑制周围污染菌的生长；然后将平皿放入37℃的培养箱中培养18h后观察结果，在加有抗菌活性的抗菌肽周围可形成一个清晰的圈，抑菌圈直径为实际抑菌圈减孔直径。抑菌试验判定标准:抑菌圈直径等于0mm为不敏，抑菌圈直径≤5mm为低敏，抑菌圈直径等于5~7mm为低度敏感，抑菌圈直径等于7~11mm为中度敏感，抑菌圈直径≥11mm为高度敏感(参考附录E)。6（资料性附录）家蝇血淋巴的的Tricine-SDS（资料性附录）配制标准曲线溶液体系取0.1mL待测样品用ddH2O稀释10倍后，加入5mL配好的考马斯亮蓝染色液，测其A595。溶液（mL）编号012345牛血清白蛋白00.8ddH2O0.20考马斯亮蓝5.05.05.05.05.05.08（资料性附录）家蝇三龄幼虫血淋巴的HPLC分析9（资料性附录）kDa97.466.24331MS1U1M