第章-生殖毒性

13三月2024第章生殖毒性1雄性生殖毒性1.1雄性生殖细胞的发生过程1.2化学物的雄性生殖毒性1.3雄性生殖毒性的检测方法1.1雄性生殖细胞的发生过程1.1.1睾丸与附睾的解剖结构1.1.2人生精小管扫描电镜像×1801.1.3精子的发生过程1.1.4睾丸功能的内分泌调节

1.1.1睾丸与附睾的解剖结构曲精小管白膜鞘膜脏层鞘膜腔输出小管直精小管附睾管睾丸网输精管1.1.2人生精小管扫描电镜像×180

血管间质细胞

精原细胞初级精母细胞精子细胞精子支持细胞1.1.3精子的发生过程精子的发生是精原细胞发育成为成熟精子的过程。精子的发生过程始于胎儿期的原始生殖细胞。出生后分化成曲细精管内的精原细胞。精原细胞在促性腺激素作用下依次进一步分裂成熟为初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞和精子。精子由间质细胞包裹释放入直精细管，并移入附睾内进一步成熟，再经输精管送入精囊贮存。从精原细胞分化为成熟的精子，不同物种所需时间不同。人64天、小鼠32天、家兔43天Wistar大鼠53.2天、牛54天。1.1.4睾丸功能的内分泌调节

下丘脑的神经内分泌细胞分泌促性腺释放激素（GnRH），可促进腺垂体远侧部的促性腺激素细胞分泌卵刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）。雄性，FSH促进支持细胞合成ABP；LH可刺激间质细胞合成和分泌雄激素（睾丸酮）。ABP可与雄激素结合，从而保持生精小管含有高浓度的雄激素，促进精子发生。支持细胞分泌的抑制素和间质细胞分泌的雄激素，又可反馈抑制下丘脑GnRH和腺垂体FSH及LH的分泌。正常情况下，各种激素的分泌量是相对恒定的，其中某一种激素分泌量升高或下降，或某一种激素的相应受体改变，将影响精子发生，并致第二性征改变及性功能障碍。

1.2化学物的雄性生殖毒性睾丸的功能主要是生成精子和合成雄激素。并受神经内分泌调节。能影响睾丸、附睾、输精管、精囊腺的结构和功能及内分泌调节功能的因素，均可致雄性生殖系统损害。1.2.1对睾丸生精细胞的影响1.2.2对内分泌功能的影响1.2.3对性功能和生殖功能的影响1.2.1对睾丸生精细胞的影响棉酚可损伤精子、精细胞和精母细胞；二硫化碳可引起睾丸萎缩、精子产生障碍、生精细胞突变，睾丸萎缩、性欲下降；铅、镉、汞、过量锰可引起睾丸、附睾、精囊退行性变；许多农药也可引起精子生成减少、睾丸萎缩、精子畸形、性功能减退。1.2.2对内分泌功能的影响铅可干扰下丘脑-垂体-睾丸轴的正常分泌功能，使FSH、LH和睾酮分泌减少。二硫化碳可使睾酮分泌减少，而FSH和LH分泌增加。睾酮分泌减少与FSH和LH分泌增加呈现相关性。1.2.3对性功能和生殖功能的影响雄性性功能包括性欲、阴茎勃起、性交、情欲高潮和射精几个方面，并受内分泌功能和精神心理因素的调节。影响其任何环节均可影响性功能。雄性生殖功能正常情况下除性功能外，还包括精子能正常发生、成熟、输送和贮存。影响任何环节均可影响正常生殖功能，影响精发生和成熟将直接影响生殖功能。上述重金属能影响性功能和生殖功能。1.3雄性生殖毒性的检测方法1.3.1精子生成分析1.3.2精子穿透试验1.3.3睾丸中标志酶活性测定1.3.4体外试验1.3.5雄性激素测定1.3.6显性致死试验1.3.7雄性生殖细胞遗传毒性检测1.3.8雄性生殖毒性病理检查1.3.1精子生成分析精子收集的方法可用交配后冲洗阴道法，但多采用处死动物后收集附睾尾部和输精管中的精子。判断精子生成情况可用下列三指标评定：精子计数：精子形态观察：精子状态分析：精子计数其是雄性生殖功能的一项重要指标。可提供有关精子发育与成熟方面的粗略信息。如果精子数目显著减少，则可以认为受试物对雄性生殖具有损害作用，但不能确定毒性作用发生在精子生成周期的哪个环节。精子形态观察其通过伊红染色在显微镜下很容易观察。精子头部和尾部的形态学改变可影响精子的运动和穿透卵细胞的能力。但该指标不够灵敏，应结合其它试验进行综合分析。精子状态分析精子状态包括精液的pH值、液化时间，精子运动能力，蛋白质、脂质和微量元素的含量等。通过该试验，可了解精子所处的微环境及精子运动等情况是否与受试物有关。该试验需结合其它试验进行综合分析。1.3.2精子穿透试验该试验是精子在体外的受精试验。它是检测精子在体外能否成功穿透去透明带的金黄地鼠卵子而受精的试验。其是常规试验所不能显示的，是常规分析的辅助试验。该试验的精子可以是大鼠、小鼠、家兔、猪、牛和人的精子。该试验可用于不育症诊断和外源化学物生殖毒性方面的检测。1.3.3睾丸中标志酶活性测定睾丸中标志酶活性的变化能可靠地较早反映受试物对睾丸功能的损害。在精母细胞和精细胞中首先出现的酶类，其含量和活性随精子的形成和成熟而达到高峰。包括：透明质酸酶、山梨醇脱氢酶、乳酸脱氢酶-x、5-核苷酸酶、α-磷酸甘油脱氢酶。在睾丸足细胞、间质细胞或精原细胞内含量最高的酶类，其活性和含量在性成熟前达到高峰，且随精母细胞、精细胞和精子的形成和成熟而降低。包括：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶、尿苷二磷酸酶、鸟苷酸脱羧酶等。1.3.4体外试验体外试验较在体试验具有简便的优点。体外试验主要将哺乳动物的生殖细胞在体外条件下进行培养，观察受试物是否引起生殖细胞改变。也可通过分离培养睾丸支持细胞和间质细胞，测定支持细胞的乳酸含量和乳酸脱氢酶活性的变化以及测定间质细胞分泌的雄激素含量来判断受试物是否对所培养细胞功能有影响。1.3.5雄性激素测定雄性激素是睾丸中产生的主要性激素，睾丸功能主要受FSH和LH和雄激素维持和调节。检测该三种激素可判断受试物对雄性功能的影响。也有助于了解受试物对雄性性功能和生殖功能影响的机制。1.3.6显性致死试验是观察指标为早期胚胎死亡的试验。其方法将接受受试物的雄性动物与雌性动物进行交配。若雄性动物的精细胞受损，与雌性的生殖细胞不能正常结合成合子，这样卵细胞就不能受精或使受精卵在着床前就死亡，即观察子宫中活胎、死胎及吸收胎等数目。本试验的特点是简便易行。但不够灵敏。1.3.7雄性生殖细胞遗传毒性检测本试验是检测雄性细胞DNA的损伤情况。具体方法有：单细胞凝胶电泳试验；小鼠睾丸染色体畸变分析试验；小鼠精子畸变分析实验；黑腹果蝇染色体隐性分析试验。1.3.8雄性生殖毒性病理检查雄性生殖毒性病理检查是检查受试物对睾丸各种细胞，特别是各级生精细胞的形态变化。检查时应注意在大体解剖的基础上，准确取材，选择合适的固定液保存病理检验材料，以保证病检的正确性。2雌性生殖毒性2.1雌性生殖细胞的发生过程与胚胎发育2.2雌性性与生殖功能的周期性调节2.3外源化学物对雌性生殖毒性2.4雌性生殖毒性的检测方法第一周胚胎发生卵子的发生卵巢：内含大量初级卵母细胞初级卵泡成熟卵泡次级卵泡原始卵泡卵细胞黄体次级卵母细胞次级卵母细胞完成第二次成熟分裂雌、雄原核形成雌、雄原核融合受精卵形成二细胞期四细胞期八细胞期桑椹胚早期胚泡晚期胚泡第7天时植入细胞滋养层内细胞群极端滋养层子宫内膜第八天两胚层分化下胚层上胚层羊膜腔合体滋养层初级卵黄囊胚外中胚层胚盘羊膜囊第10天人胚胚外体腔初级卵黄囊次级卵黄囊体蒂第13天人胚发育第十四天人胚发育卵黄囊第15天胚盘羊膜体蒂原条脊索前板第16天胚盘原凹脊索原沟第17天胚盘神经板原条泄殖腔膜三胚层胚盘横断外胚层胚内中胚层内胚层受精后第20天：

神经肠管形成神经板

神经沟

神经褶口咽膜神经板泄殖腔膜第21天胚盘背面观口咽膜泄殖腔膜脊索神经沟神经嵴围心腔

胚内体腔20和23天26和28天2.2雌性性与生殖功能的周期性调节卵巢的周期性变化与动情周期密切相关。卵巢内卵子的发生和成熟受垂体分泌的FSH和LH周期性的正向调节，FSH和LH又受下丘脑分泌的促性腺释放激素的正向调节。FSH和LH促进初级卵母细胞成熟并发育成次级卵母细胞。并在卵泡膜内层细胞分泌的雌激素作用下，促进子宫内膜和生殖器的发育。FSH、LH和雌激素达高峰时促进成熟卵泡排卵，并形成黄体。卵细胞受精后，黄体在绒毛膜促性腺激素的作用下继续发育，并分泌孕激素和雌激素，以维持妊娠和副性器官的发育。否则黄体萎缩，孕激素水平下降，子宫内膜脱落。由于雌性生殖功能的复杂性，外源化学物对雌性生殖系统的影响远大于雄性。2.3外源化学物对雌性生殖毒性2.3.1对卵细胞的影响2.3.2对内分泌功能的影响2.3.3其它毒性作用2.3.1对卵细胞的影响排卵前的卵母细胞受化学物的影响最敏感。镉可直接损害卵母细胞的遗传物质；二硫化碳可影响卵巢、受精卵和胚胎；双环氧-4-乙烯环已烯可使卵母细胞数减少；环磷酰胺、胺草灵、克菌丹可致雌性生殖细胞染色体畸变；多氯联苯能降低子代卵子的受精能力和胚胎的着床率。2.3.2对内分泌功能的影响对下丘脑-垂体-性腺轴的任何环节的影响，均可引起雌性生殖功能的损害。苯及其同系物，可能直接作用于丘脑、垂体和卵巢，使分泌异常而导致月经异常等生殖系统损害。有机氯农药林丹、开蓬等可使血中LH和催乳素降低和FSH浓度升高，而使雌性动物阴道开启和排卵延迟或停止排卵、死胎和自然流产。2.3.3其它毒性作用化学物对雌性生殖系统的毒害也可表现在子代。表现为畸形、死胎、胎儿功能发育不全等。由于雌性生殖的复杂性，化学物对各种生殖功能毒性作用在整个生命过程的不同阶段都可出现。2.4雌性生殖毒性的检测方法2.4.1体外试验2.4.2在体动物试验2.4.1体外试验体外试验可用以阐明毒对雌性动物生殖损害的作用部位和机制。全面试验方案见表7-2：表7-2成年雌性动物生殖毒性作用部位与机制及其检测方法1作用部位可能的改变的机制评价方法下丘脑神经递质或信号的传递GnRH的合成与分泌FSH、LH及甾体的受体暂无方法激素测定受体分析表7-2成年雌性动物生殖毒性作用部位与机制及其检测方法2作用部位可能的改变的机制评价方法垂体前叶FSH、LH及PRL的合成与分泌GnRH、FSH、LH及甾体的受体激素测定及GnRH应答受体分析卵巢卵母细胞及闭锁细胞卵泡或颗粒细胞上FSH、LH受体E3及E4的合成与分泌对黄体生成的敏感性记数及形态检查受体分析激素检测体外试验表7-2成年雌性动物生殖毒性作用部位与机制及其检测方法3作用部位可能的改变的机制评价方法卵子表面蛋白与精子相互作用透明带异常、代谢过程雌雄核融合植入生化测定精子穿透试验形态学检查植入与黄体激素输卵管边缘的运动、绒毛生成及其功能E2及E4受体数精和卵子的运动液体环境形态学检查受体分析回收和计数生化测定表7-2成年雌性动物生殖毒性作用部位与机制及其检测方法4作用部位可能的改变的机制评价方法子宫E2及E4受体数PGE和PGE2分泌蛋白及腺蛋白分泌精存活与运输腔内液精子及胚胎分泌物接触分娩受体分析PG检测生化测定回收和计数生化测定物质分析dystocia指数表7-2成年雌性动物生殖毒性作用部位与机制及其检测方法5作用部位可能的改变的机制评价方法子宫颈精子屏障体外试验阴道精子接触分泌物物质分析乳腺乳汁中受试验物乳汁成分的变化乳汁生产量减少物质分析物质分析乳汁计量2.4.2在体动物试验由于雌性生殖的复杂性，其毒理学评价较困难，下述两类在体动物试验仍为主要评价方法：一代繁殖试验或多代繁殖试验和致畸试验；三阶段生殖试验：是分别在三个不同阶段给予受试物，以观察其对生殖功能的影响。妊娠前期和初期（第一阶段）和器官形成期（第二阶段），与繁殖试验和致畸试验类似；围产期（人类怀孕28周到产后一周）及授乳期（第三阶段），是观察受试物对胎儿和新生儿发育的影响。3致畸试验3.1在体动物致畸试验3.1.1基本原理3.1.2基本方法3.1.3结果判断3.2离体致畸试验3.1.1基本原理化学物在胚胎器官形成期（妊娠母体敏感期），可能使细胞分化、器官形成和正常发育受到损害，以致出现胎仔器官的器质性缺陷而呈现畸形。故可通过在上述母体敏感期接触受试物后观察胚胎及胎仔的发育状况，来评价该受试物是否具有致畸作用。3.1.2基本方法动物选择动物交配处理剂量分组动物剖检胎仔检查动物选择除参照一般毒性试验中选择动物的一般原则外，还应特别注意妊娠期较短而一致、产仔数多和胎盘结构与人类接近且自发性畸形发生率低等特点。同时还应考虑易于检查。一般选用两种哺乳动物，首选大鼠，其次为小鼠和家兔。动物交配处理选择健康性成熟的未曾孕产雌雄动物，雌雄按1：1或2：1同笼交配。交配次日早晨阴道图片检查精子或检查阴栓，凡发现检出精子或阴栓，即开始计数（第0天）孕期。将怀孕动物随机分组，于妊娠第7-15天（敏感期）与人实际接触受试物情况一致的方式与途径将受试物给予动物。试验期间每2-3天称体重，以反映对妊娠的影响。剂量分组原则上要求既要求出最大无作用量，以及引起致畸的阈剂量，又要保证母体生育能力，不致母体大批流产和过多胚胎及母体死亡。一般分三个剂量组和对照组，三个剂量为等比关系。高剂量组要求可引起母体轻度中毒，低剂量组不应观察到任何中毒症状。可选雌性动物LD50的1/5-1/3为高剂量，LD50的1/50-1/30为低剂量；也可以亚慢毒试验中的最大无作用量作为高剂量组，以其1/30为低剂量组。动物剖检鼠类有残食畸形胎仔的习性，应在预产期前1-2天处死母鼠进行检查。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠在第18-19天。剖检时先脱臼法处死动物，后从腹中线剖腹，暴露子宫和卵巢，为胎仔检查作准备。胎仔检查检查两侧子宫每窝胎仔中活胎数、晚期死胎数、早期死胎数、吸收胎数及各种胎仔的特征。对活胎测量其体重、体长、尾长和性别。对较大的动物应取出卵巢，检查黄体数。最后检查胎仔外观畸形检查、内脏及软组织畸形检查和骨骼畸形检查（P130-131表7-3、7-4、7-5）3.1.3结果判断平均着床率=怀孕母鼠数/交配母鼠数?平均活胎率=活产胎数/怀孕母鼠数?着床后死亡率=（吸收胎数+死胎数）/着床数畸胎出现率=畸形胎仔总数/活产胎仔总数?活胎畸形出现率=活胎畸形数/活胎总数母体畸胎出现率=畸胎的母体数/妊娠母体数致畸指数=母体LD50/胎仔最小致畸作用量?3.2离体致畸试验目的：初步筛选致畸物及其致畸作用机制。方法：体外全胚培养、器官培养和细胞胚培养试验。优点：省时、省力；直接对人类血、尿进行试验，直接观察人类的接触反应；易于控制试验条件，减少干扰引起的误差。4繁殖试验4.1动物选择与剂量分组4.2试验步骤4.3观察指标4.4结果判断4.1动物选择与剂量分组选择健康刚断乳的大鼠。每组20只雌鼠、10只雄鼠。设对照组、高剂量组（90天或长期毒性试验的最大无作用量）和低剂量组（1/30最大无作用量或人类可能摄