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文档简介
第三章发酵工程
绪论医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品化学工程生物化工生物加工行业传统生物技术现代生物技术基因工程菌发酵1.1发酵过程的意义及组成抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等绪论基因工程酶工程细胞工程发酵工程产物产品产品内容一、发酵工程概述二、发酵设备与基本工艺过程三、发酵过程控制四、发酵工程的应用一、发酵工程概述1.1发酵的定义1.2发酵工程的应用范围1.3微生物发酵技术的发展历史1.4发酵过程的组成部分发酵一词的来源
“发酵”(Fermentation)一词是拉丁语“沸腾”(fervere)的派生词,它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。狭义“发酵”的定义在生物化学上发酵:指微生物在无氧条件下,分解各种有机物质产生能量的一种方式。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量,丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。广义“发酵”的定义
工业上所称的发酵:泛指利用微生物细胞制造某些产品或净化环境的过程,它包括厌氧培养的生产过程,如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等,以及通气(有氧)培养的生产过程,如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产物,也包括菌体细胞、酶等。1.1发酵的定义传统发酵用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象,或者是指酒的生产过程。生化意义上的发酵指微生物在无氧条件下,分解各种有机物质产生能量的一种方式,或者更严格地说,发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。生理学意义上的发酵指葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。发酵工程的概念:指采用现代工程技术手段,利用微生物的某些特定功能,为人类生产有用的产品,或直接把微生物应用于生产过程的一种新技术。发酵工程是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来,利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。它以培养微生物为主,所以又称微生物工程。发酵工程的含义给微生物提供适宜的生长条件,利用微生物的某种特定功能,通过现代化的技术手段生产出人类所需要的产品的工程。微生物--是主体现代化的技术手段--是技术支撑菌体或菌体代谢产物-----微生物工程二、发酵工程的内容发酵工程主要包括菌种的培养和选育,发酵条件的优化,发酵反应器的设计和自动控制,产品的分离纯化和精制等。除食品工业外,化工、医药、冶金、能源开发、污水处理、防腐、防霉等开发,给发酵工程带来新的发展前景。(图片)
发酵工程的内容菌种的选育发酵条件的工艺控制产物的分离和精制菌种的分离、筛选和鉴定;菌种的选育(物理、化学和基因工程等方法);生长条件的确定。营养条件(碳源、氮源、无机盐、微量元素等);环境条件(温度、pH、溶解氧、泡沫、杂菌等)。菌体与发酵液的分离;产物的纯化与精制(不同产品要求不同);废物、废水的回收处理。第一大核心内容第二大核心内容实现经济效益的关键目前具有生产价值的发酵类型有以下五种:
1、微生物菌体发酵:是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。
●传统的菌体发酵工业:有用于面包制作的酵母发酵(见图)及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵两种类型。●新的菌体发酵可用来生产一些药用真菌:如香菇类、天麻共生的密环菌、以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子菌的灵芝等药用菌(见图)。这些药用真菌可以通过发酵培养的手段来生产出与天然产品具有同等疗效的产物。2、微生物酶发酵
微生物酶制剂有广泛的用途:
a、多用于食品和轻工业中;
b、酶也用于医药生产和医疗检测中。3、微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多,已知的有17个大类,其中16类属于药物。●初级代谢产物—是菌体生长繁殖所必需的,如氨基酸、核甘酸、蛋白质、核酸、糖类。●次级代谢产物—一些具有特定功能的产物,如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等,与菌体生长繁殖无明显关系。初、次级代谢产物的比较4、微生物的转化发酵
●微生物转化—是指利用微生物细胞的一种或多种酶,把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括:脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱梭反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。
5、生物工程细胞的发酵
●概念:生物工程细胞的发酵是指利用生物工程技术所获得的细胞,如DNA重组的“工程菌”,细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。
4.1.2发酵技术的特点
发酵过程以生命体的自动调节方式进行,数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成。反应通常在常温常压下进行,条件温和,能耗少,设备较简单。原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主,可以是农副产品、工业废水或可再生资源(如植物秸秆、木屑等),微生物本身能有选择地摄取所需物质。发酵工程
4.1发酵工程概况容易生产复杂的高分子化合物,能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应。发酵过程中需要防止杂菌污染,大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌,空气需要过滤等。发酵工程
4.1.2发酵技术的特点4.1.3发酵技术的应用
医药工业
抗生素、维生素、激素疫苗和菌苗等发酵工程
4.1发酵技术应用食品工业
微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类食品添加剂(柠檬酸、乳酸、天然色素等)发酵工程
4.1.3发酵技术的应用能源工业
酒精沼气氢能发酵工程
4.1.3发酵技术的应用化学工业
可降解的生物塑料化工原料(乙醇、丙酮、丁醇、癸二酸等)生物表面活性剂及生物凝集剂发酵工程
4.1.3发酵技术的应用冶金工业
黄金开采和铜、铀等金属的浸提发酵工程
4.1.3发酵技术的应用农业
生物固氮生物杀虫剂微生物饲料发酵工程
4.1.3发酵技术的应用环境保护
使用生物肥料,生物杀虫剂降解有毒物质净化废水废气,处理石油污染发酵工程
4.1.3发酵技术的应用微生物发酵技术的发展历史传统发酵技术现代发酵技术纯培养技术代谢控制通风搅拌遗传工程技术天然发酵时代发酵技术起源于古老的酿造食品工业。当时人们还没有认识到微生物的存在,更不清楚微生物与发酵的关系,是单凭经验而继承的产业。这一酿造领域的发酵,对于技术的进步有顽固拒绝的倾向,还由于自古以来,长期积累的工艺相当成熟,因而各国都不怎么从根本上进行改进。这个时代称为天然发酵时代。天然发酵时期白酒的酿造农家酱的酿造酸菜的酿造公元前4000多年前,生产实践的结果。发酵工业第一个转折期:纯培养技术十七世纪荷兰博物学家列文霍克用自制的显微镜首先发现了微生物。到了1860年,法国的巴斯德,偶然发现:发酵的原因是由微生物造成的。汉逊和林德于1878年研究出“啤酒酵母”的单一培养技术,到了1881年李斯德和柯赫
“细菌”的纯培养技术又获得成功。大量实践经验的积累、商业化培养基的开发及生产菌种的改良,促进了发酵工业的发展并使之趋于多元化。纯培养时期吕文·胡克巴斯德科赫
安东·列文虎克(AntonyvenLeeuwenhoek,1632-1723)在1680年前后发现了自然界中存在的细菌、酵母菌、原生动物等微小生物。微生物学的奠基人——伟大的巴斯德1857年巴斯德证明发酵是由于微生物的作用发酵与微生物的关系巴斯德著名的曲颈瓶实验证明:是微生物引起发酵。发酵产生微生物?微生物引起发酵?
法国化学家、微生物学家路易·巴斯德(LouisPasteur,1822-1895)1、否定了生命“自然发生”学说;2、解决了当时工、农、医方面的许多难题,推动了生产的发展;3、奠定了微生物学的理论基础;4、创造了一些微生物学实验方法。二、杰出科学家的贡献
无菌营养液出现微生物无菌营养液无生命出现加热无菌营养液无生命出现巴斯德的雁颈瓶实验德国科学家柯赫(RobertKoch,1843-1910)
发现了许多病原菌,如炭疽杆菌、结核杆菌、霍乱弧菌等;发明了固体培养基,提出了纯培养的概念和方法;创造了细菌染色的方法。发酵工业第二个转折期:通风搅拌技术1929年,英国人A·Fleming发现了青霉菌生产青霉素的功能和青霉素的作用。那时是使用表面培养青霉菌的生产方法来生产青霉素,因此生产量有限,所以根本满足不了人们需要。1943年,英、美共同开发了通风搅拌深层培养法,才实现了青霉素大规模工业生产。以青霉索发酵工业的诞生为转机,引起了一系列抗生素工业的出现,使发酵工业成为合成化学独特领域而席卷制药工业界。霉菌菌落周围出现抑制萄
葡球菌生长的抑制现象产黄青霉菌落细菌生长抑制区域正常细菌生长区域---抗生素的发现发酵工业第三个转折期:代谢控制发酵技术本世纪五十年代,木下祝郎等人,广泛吸收了生物化学、酶化学以及微生物遗传学等基础学抖的成果,研究出能控制代谢过程的发酵技术,使氨基酸、核酸发酵得以商品化。发酵工业第四个转折期:遗传工程技术随着遗传工程学的发展,为人类定向育种提供了新的途径,可以赋予微生物细胞具有生产较高等生物细胞所产生的化合物的能力,创造出各种超级微生物服务于人类。近年来,由于基因工程在发酵技术中的应用,一些极为珍贵的精细化工产品如生理活性肽物质(如人生长激素、胰岛素、干扰素、尿激酶、高特性抗体等),都可以通过发酵法来生产。4.2
微生物发酵过程
微生物发酵过程即微生物反应过程,是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。发酵工程
4发酵工程好氧性发酵
在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气。如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵,利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵,利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。发酵工程
4.2微生物发酵过程厌氧性发酵
在发酵时不需要供给空气。如乳酸杆菌引起的乳酸发酵,梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。
发酵工程
4.2微生物发酵过程固体发酵液体发酵
敞口发酵密闭发酵浅盘发酵深层发酵
液体深层发酵发酵工程
4.2微生物发酵过程4.2.1发酵工业中的常用微生物
细菌放线菌酵母菌霉菌其他微生物发酵工程
4.2微生物发酵过程放线菌1、常用的细菌
大肠杆菌应用:对谷氨酸定量分析,生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
乳酸杆菌应用:乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作
枯草芽孢杆菌应用:生产淀粉酶2、酵母菌种类:酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母。应用:生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪。啤酒酵母红酵母面包酵母3、霉菌曲霉属应用:生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用:酱油、酱类(淀粉酶)米曲霉应用:产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲
毛霉应用:可以产生蛋白酶,我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类:米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用:酿酒青霉菌应用:生产青霉素、葡萄糖氧化酶4、放线菌种类:龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用:各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素4.2.2
培养基
培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。发酵工程
4.2微生物发酵过程霉菌孢子培养基种子培养基发酵培养基4.2.2.1
培养基的种类
发酵工程
4.2.2培养基细菌酵母菌4.2.2.2发酵培养基的组成
碳源
葡萄糖、果糖蔗糖、麦芽糖淀粉、纤维素等发酵工程
4.2.2培养基氮源
有机氮源(黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉等)无机氮源(氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等)发酵工程
4.2.2.2发酵培养基的组成无机盐和微量元素
磷酸盐、硫酸盐、氯化钠、氯化钾镁、铁、钴、锌、锰等
发酵工程
4.2.2.2发酵培养基的组成蓝藻生长因子
维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和一些动植物组织的浸液,是生长因子的丰富来源。发酵工程
4.2.2.2发酵培养基的组成水
水是培养基的主要组成成分。它既是构成菌体细胞的主要成分,又是一切营养物质传递的介质,而且它还直接参与许多代谢反应。
发酵工程
4.2.2.2发酵培养基的组成产物形成的诱导物、前体和促进剂
如合成青霉素G的苯乙酸,合成红霉素的丙酸等发酵工程
4.2.2.2发酵培养基的组成摇瓶种子罐生产罐培养液细胞分离菌体培养基灭菌培养基配制培养基原料无细胞上清液产品抽提产品精制产品包装废水处理储备菌种4.2.3
发酵的一般过程发酵工程
4.2微生物发酵过程发酵条件的工艺控制菌种的选育发酵产物分离和精制
自然选育诱变育种杂交育种基因工程育种发酵的过程菌种的选育要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品,最重要的是要有优良的菌种。怎样才能得到优良的菌种呢?如果生产的是微生物直接合成的产物可以从自然界中先分离出相应的菌种,再用物理或化学的方法使菌种产生突变,从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。如果生产的是一般微生物不能合成的产品
可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造,以构建工程细胞或工程菌,从而达到生产相应产品的目的
选育的目的:改善菌种的特性,使产量提高,改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。
选育的方法:
A、自然选育
B、诱变育种
C、杂交育种D、基因工程育种自然选育诱变育种染色体加倍后的草莓(上)野生草莓(下)诱变育种杂交育种甲
生长快、产量低乙生长慢、产量高基因重组如:生长快、产量高获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入筛选和鉴定应用基因工程育种4.3
液体深层发酵4.3.1
发酵的操作方式
4.3.1.1分批发酵
营养物和菌种一次加入进行培养,直到结束放罐,中间除了空气进入和尾气排出,与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程。
发酵工程
4发酵工程根据不同发酵类型,每批发酵需要十几个小时到几周时间。全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐,所需时间的总和为一个发酵周期。
发酵工程
4.3.1.1分批发酵典型的分批发酵工艺流程图
发酵工程
4.3.1.1分批发酵微生物分批培养的生长曲线
1.延滞期2.加速生长期3.指数生长期4.减速期5.稳定期6.衰亡期
发酵工程
4.3.1.1分批发酵4.3.1.2连续发酵
以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同的速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定,微生物在稳定状态下生长。发酵工程
4.3.1发酵的操作方式4.3.1.3
补料分批发酵
又称半连续发酵,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术,是指在微生物分批发酵中,以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。发酵工程
4.3.1发酵的操作方式4.3.2发酵工艺控制
温度对发酵过程的影响是多方面的,它会影响各种酶反应的速率,改变菌体代谢产物的合成方向,影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外,温度还对发酵液的理化性质产生影响,如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等,进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。发酵工程
4.3液体深层发酵4.3.2.1
温度pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面:①影响酶的活性,当pH值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢;②影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄;③影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离,从而影响微生物对这些物质的利用;④pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。另外,pH值还会影响某些霉菌的形态。发酵工程
4.3.2发酵工艺控制4.3.2.2
pH值对于好氧发酵,溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物在进行深层培养时,需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成,氧的不足会造成代谢异常,产量降低。现在可采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。发酵工程
4.3.2发酵工艺控制4.3.2.3
溶解氧浓度4.3.3发酵设备
一个优良的发酵装置应具有严密的结构,良好的液体混和性能,较高的传质、传热速率,同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。发酵工程
4.3液体深层发酵发酵工程
4.3.3发酵设备发酵罐及其控制系统机械搅拌式发酵罐是发酵工厂常用的类型之一。它是利用机械搅拌器的作用,使空气和发酵液充分混合,促进氧的溶解,以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。
发酵工程
4.3.3发酵设备4.3.3.1
机械搅拌式发酵罐发酵工程
4.3.3.1机械搅拌式发酵罐在通风搅拌式发酵罐中,通风的目的不仅是供给微生物所需要的氧,同时还利用通入发酵罐的空气,代替搅拌器使发酵液均匀混合。
发酵工程
4.3.3发酵设备4.3.3.2
通风搅拌式发酵罐小型发酵罐厌氧发酵也称静止培养,因其不需供氧,所以设备和工艺都较好氧发酵简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。
发酵工程
4.3.3发酵设备4.3.3.3
厌氧发酵设备啤酒发酵罐发酵工程
4.3.3.3厌氧发酵设备4.3.4下游加工过程
从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。
发酵工程
4.3液体深层发酵双效浓缩器离心机结晶罐下游加工的工艺流程
预处理发酵液高度纯化(精制)细胞碎片分离细胞破碎细胞分离
成品加工初步纯化(提取)胞外产物发酵工程
4.3.4下游加工过程下游加工过程4个阶段发酵液预处理和固液分离;提取;精制;成品加工。发酵工程
4发酵工程4.4固体发酵
原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业中的副、废产品;一般都是开放式的,无菌要求不高;所需设备简单,操作容易;劳动强度大,不便于机械化操作,微生物品种少、生长慢,产品有限。发酵工程
4发酵工程固体发酵实例
例子原料所用微生物
蘑菇生产麦秆、粪肥双孢蘑菇、埃杜香菇等泡菜包心菜乳酸菌酱油黄豆、小麦米曲霉大豆发酵食品大豆寡孢根霉干酪凝乳娄格法尔特氏青霉堆肥混合有机材料真菌、细菌、放线菌花生饼素花生饼嗜食链孢霉金属浸提低级矿石硫芽孢杆菌有机酸蔗糖、废糖蜜黑曲霉酶麦麸等黑曲霉污水处理污水成分细菌、真菌和原生动物发酵工程
4.4固体发酵青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。1928年为英国人FlemingA.发现,20世纪40年代投入工业生产。
4.5典型产品的发酵生产
发酵工程
4发酵工程4.5.1抗生素发酵生产
目前全世界用于生产青霉素的高产菌株,大都由菌株WisQ176(一种产黄青霉,Penicillium
chrysogenum)经不同改良途径得到。青霉素工业发酵生产水平已达85000U/mL以上。发酵工程
4.5.1抗生素发酵生产4.5.1.1青霉素发酵生产菌株碳源:淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液。氮源:玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮。前体:苯乙酸或苯乙酰胺。无机盐:包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。发酵工程
4.5.1抗生素发酵生产4.5.1.2青霉素发酵生产培养基4.5.1.3
青霉素发酵工艺冷冻管
斜面母瓶孢子培养
25℃,6~7天
大米孢子
孢子培养
25℃,6~7天
一级种子罐
种子培养
25℃,40~45h,1
2vvm二级种子罐
种子培养
25℃,13~15h,1
1.5vvm
发酵罐
发酵
22~26℃,1
1~0.8vvm,6~7天放罐
提炼冷至15℃
发酵工程
4.5.1抗生素发酵生产过滤:采用鼓式真空过滤器;提炼:溶媒萃取法;脱色:活性炭脱色;结晶:丁醇共沸结晶法。发酵后处理
发酵工程
4.5.1.3青霉素发酵工艺谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种,谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型和最成熟的。谷氨酸发酵生产菌种主要有棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、小杆菌属(Microbacterium)及节杆菌属(Arthrobacter)的细菌。
发酵工程
4.5典型产品的发酵生产4.5.2
氨
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