家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术

家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术    范围本标准规定了家畜化脓隐秘杆菌病诊断的操作程序和判定标准。本标准适用于牛、羊、猪等经济型家畜化脓隐秘杆菌病的诊断、检疫及流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件：化脓隐秘杆菌病（Trueperellapyogenesdisease）是指由化脓隐秘杆菌（Trueperellapyogenes）感染动物引起的以化脓性炎症为主的传染病，常导致牛、羊、猪等多种经济型家畜和野生动物的化脓性肺炎、子宫内膜炎、乳房炎、皮下脓肿、流产和死胎等，严重时可引发败血症而死亡。试剂与器材试剂普通琼脂平板、鲜血琼脂平板：配制方法参见附录A革兰氏染色试剂盒、细菌微量生化鉴定管：生物试剂公司生产消毒水、75%酒精、甘油（分析纯）、0.85%生理盐水、无菌双蒸水2×TaqPCRMasterMix（含染料）、DNA分子量标准品、1×电泳缓冲液、琼脂糖、核酸染料器材超净工作台、台式高速冷冻离心机、恒温培养箱、显微镜、冰箱（4℃、-20℃或-80℃）、PCR扩增仪、水浴锅、电子天平、水平电泳仪、凝胶成像系统、pH计、灭菌锅解剖手术刀、剪刀、镊子、接种环、酒精灯、一次性注射器（10mL）、输精枪微量移液器（10μL、50μL、200μL、1000μL）无菌塑料制品：培养皿（直径90mm）、吸头、离心管（2mL）、PCR管、塑封袋、一次性手套临床诊断流行病学化脓隐秘杆菌属于条件性致病菌，可持续存在于易感动物的皮肤、上呼吸道、泌尿和生殖道等黏膜表面，常呈散发；病原菌可通过患病动物上呼吸道、乳房、外阴等的分泌物和粪便排出，直接或间接通过饮水器和其他污染物传播；该菌还可通过打耳号、去势等途径感染。临床症状化脓性肺炎病畜体温升高至40℃左右，食欲减退并伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道症状，渐进性消瘦；随着病程延长，病畜呼吸衰竭而亡。子宫内膜炎临床上常见奶牛、母羊和母猪因化脓隐秘杆菌感染导致的急性细菌性子宫内膜炎，延误治疗或治疗不当则转化为慢性子宫内膜炎。患病母畜轻者无全身症状，发情正常，但屡配不孕或配种后容易发生流产、死胎等；严重的伴有全身症状，如精神沉郁，体温升高，呼吸加快，食欲下降，反刍无力等表现，发情微弱或不发情。化脓性乳房炎临床上常见奶牛“夏季乳房炎”，也称为“未经产牛乳房炎”或“化脓棒状杆菌乳房炎”，是停乳期奶牛和青年母牛发生在夏季的乳腺化脓性炎症，在蚊蝇的协助下发生“牛-牛传播”。乳用山羊、绵羊和马也有发生。发病初期,患病母畜一个或多个乳区发生炎症和水肿,乳房分泌物变色、黏稠，呈奶油样或浆液样，且常伴有恶臭味；进而乳区变松软，脓肿向外破溃，并表现出全身症状，发热、食欲不佳、反刍停止、昏迷等；有时可见母牛后肢关节肿胀，发生渐进性跛行；个别病牛发生败血症而死亡。化脓性关节炎常见于犊牛和仔猪，患病动物精神沉郁，采食量下降，关节肿胀，跛行或不能站立。皮下或肌肉脓肿常见于反刍动物、猪和野生动物（如林麝、鹿、狐、貂等）等，因化脓隐秘杆菌感染动物受损的皮肤或黏膜所引起的慢性传染性疾病，仅会造成动物体质衰弱，通常不会引起临床症状；颊部、体表、淋巴结等皮下部位的脓肿肉眼可见，肌肉脓肿仅在屠宰或尸检时能被发现。病理学变化化脓性肺炎剖检可见喉头及气管中存在泡沫样黏液；胸腔有脓性浑浊积液，胸膜增厚；肺部表面有大小不等的黄白色脓肿或坏死灶、间质增宽并伴有不同程度的充血、实质性肉变。部分病例可见肝脏、脾脏、淋巴结弥漫性出血、肿大；腹腔内积有脓液，肠道液化。子宫内膜炎阴道检查可见脓性排出物，子宫颈口不同程度的肿胀和充血；病畜发情期分泌物量多，不能成拉丝状；或量少、粘稠、浑浊、呈灰白色或灰黄色。化脓性乳房炎切开病畜乳房可见乳腺组织内有大小不等的化脓灶，呈弥散分布，其内充满黄白色或黄绿色的脓性渗出物。化脓性关节炎剖检可见关节腔内有脓汁，关节软骨上有黄色干酪样物。皮下或肌肉脓肿剖检可见脓肿从几毫米至几厘米大小不等，常有较厚的纤维素包膜，并含有粘稠程度不一的乳白色或黄绿色脓汁。淋巴结脓包病例剖检还可见淋巴结被大量结缔组织包裹，质地坚硬，内含白色或灰白色的牙膏状脓汁。病原菌的分离培养采样发病畜样品采集采样前将家畜固定，用毛刷刷去其身体和乳区粘附的污物，并用温水将脓包、生殖道口或乳房擦洗干净，再用消毒液和75%酒精充分消毒取样部位，带上无菌手套进行后续操作：脓汁的采集：用无菌注射器缓慢抽出脓液，注入无菌的离心管中。乳汁的采集：人工挤乳，弃去头3股乳汁，将第4股乳汁用无菌的离心管接住。阴道分泌物的采集：将套有无菌管套的输精枪插入子宫体，然后将输精枪抽出，用10mL无菌注射器对准管套口将子宫黏液吸出，注入无菌的离心管中。死亡畜样品采集按照NY/T541的要求，无菌采集病变的肺脏、脾脏、淋巴结等小块组织，放入无菌塑封袋中；胸腔积液、关节液和脓汁等液体样品放入无菌的离心管中。样品的保存样品于2℃～8℃保存，并在24h内送至实验室进行细菌的分离培养。如果在24h内不能送达的，应将组织块剪碎后，加入无菌的终浓度为50%甘油的生理盐水；液体样品以1:1的体积比例加入无菌的含50%甘油的生理盐水。混匀后放-20℃或者-80℃长期保存。细菌分离培养接种样品接种应在超净工作台内进行。用无菌镊子和剪刀处理组织病料，露出新的无菌切面，用灼烧后的接种环自切面处伸入组织内部，然后划线接种于普通琼脂平板和鲜血琼脂平板；液体样品直接用无菌接种环蘸取后划线。菌落形态观察接种后的平板于37℃恒温培养箱倒置培养48h，观察菌落特征。普通琼脂平板上不生长，鲜血琼脂平板上形成的菌落形态单一，呈白色或灰白色，圆形，湿润，半透明，表面光滑隆起，直径约1mm，且菌落周边形成透明的β-溶血环，则为化脓隐秘杆菌疑似菌落。病原菌的鉴定染色镜检革兰氏阳性，无荚膜，无芽孢，呈散在分布，形态不均一的棒状短杆菌。生化鉴定生化试验挑取符合4.2特征的可疑菌落，按照商业化的生化反应管说明书进行生化试验。生化特性参照试剂盒内说明书的判定标准，记录生理生化试验结果。化脓隐秘杆菌生化反应结果生化试验项目反应结果生化试验项目反应结果葡萄糖+甘露醇－蔗糖+尿素－乳糖+甲基红试验+半乳糖+吲哚实验－麦芽糖+硝酸盐还原试验－棉籽糖－触酶试验－果糖+VP试验－山梨醇+七叶苷－结果判定若疑似菌落的生化特性与标准化脓隐秘杆菌生化特性（表1）一致，可确认该菌为化脓隐秘杆菌。PCR鉴定模板制备挑取化脓隐秘杆菌疑似菌落，或挑取符合表1生化特性的菌落，悬浮于1mL灭菌的0.85%生理盐水中，充分打散制成菌悬液，在4℃条件下12000r/min离心5min，弃上清。加入50μL无菌双蒸水，重悬菌体，水浴煮沸10min，然后冰浴10min，在4℃条件下12000r/min离心5min，上清液为DNA模板，用于后续PCR扩增。对阳性对照（化脓隐秘杆菌ATCC49698）同步进行模板提取。引物序列检测基因是化脓隐秘杆菌保守的特异性基因plo（溶血素编码基因）。上游引物序列：5'-TCATCAACAATCCCACGAAGAG-3'；下游引物序列：5'-TTGCCTCCAGTTGACGCTTT-3'。扩增片段大小为150bp。反应体系每个样品建立25μLPCR反应体系，见表2。用无菌双蒸水作为阴性对照。化脓隐秘杆菌plo基因扩增体系配置表试剂名称加样体积/μL2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2灭菌去离子水8.5PCR循环条件预变性94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，结束反应，4℃保存。PCR产物电泳用电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶，加热融化后，添加工作浓度的核酸染料，凝固备用。取6μLPCR产物加入加样孔，同时加DNAmarker作为分子量参考。5V/cm恒压下电泳20min～30min，用凝胶成像系统观察分析电泳结果。结果判定阳性对照扩增出150bp的条带，同时阴性对照未见有PCR扩增条带，检测结果成立。被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。综合判定符合5规定的流行病学、临床症状和病理变化，判定为临床疑似病例。临床疑似病例按6规定的进行细菌的分离培养，经7.1染色镜检后，用7.2和7.3中的任一方法检测，结果为阳性者，可确诊为化脓隐秘杆菌病。注意事项实验室生物安全要求按照GB19489执行。

（规范性附录）

培养基的配制普通琼脂平板成分蛋白胨10g牛肉膏5g氯化钠5g琼脂10g~15g蒸馏水1000mL制法将除琼脂以外的的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，调pH至7.2~7.4。加入琼脂，121℃高压灭菌15min。高压后的培养基冷却至50℃~60℃，于超净工作台中倾注到直径为90mm的无菌塑料平皿中。待琼脂充分冷却成形后，将平板倒置于4℃冰箱内备用。现有厂家专门配制、出售普通琼脂干粉剂，用时按说明书称取，加水溶解，灭菌后即可。鲜血琼脂平板成分蛋白胨10g牛肉膏