出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法

出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法第一法环状脂肪酸芽孢杆菌检验(常规方法)处理过的样品稀释液，无菌过滤样品并用20mL.清洗液(如无菌蒸馏水或去离子水)冲洗滤膜后，无菌取出滤膜，将第一个膜置于K琼脂上，另一个膜置于YSG琼脂或BAT琼脂上，避免气泡产生。与此同时，将对照菌株A.acidoterrestris和A.atidoraldarivs在相同平板上划线。该方法检出限为1CFU/对于不能过滤的样品需进行增菌处理。将100ml.加热处理的样品于45℃±1℃进行增菌培养，下一步按6.1.7操作。该方法为定性检测方法。7.1.5直接涂布平板取0,1ml.热处理样品接种于K琼脂和YSG琼脂或BAT琼脂上。与此同时，将对照菌株A.ari-dwerrestris和A.acidcaldarias在相同平板上划线，下一步按6.1.6操作。该方法适合污染量较大的样品检测。7.1.6平板培养将所有平板和增菌肉汤于45℃±1℃培养2d~5d,观察有无菌落生长，在培养过程中可以将平板置于密封袋或其他密封容器中来避免培养基干燥。7.1.7增菌肉汤的传代培养增菌培养2d后，轻混增菌肉汤，取一菌环菌液接种于K琼脂和YSG琼脂或BAT琼脂上进行传代培养，如果(至少培养2d)无典型的环状脂肪酸芽孢杆菌菌落生长，将肉汤增菌5d后，再进行传代接种，每次传代培养的同时.将对照菌株A.aciduterrestris和A.atidocaldarivs进行划线培养。7.1.8可疑菌确证试验检查K琼脂，YSG和BAT球脂上的菌落，选择每种菌落形态的多个菌进行确证试验。从每个挑选的菌落一部分划线接种于一块K琼脂平板、一块中性pH培养基平板(如：菌落计数平板、TSA或脑心侵液琼脂)和两个YSG琼脂平板，将其中1个YSG琼脂平板在65℃±1℃培养2d~3d,其余各平板在45℃±1℃培养3d~5d。YSG和BAT能够支持目前已知的环状脂助酸芽泡杆菌属中各个种的组菌生长，与K琼脂相比，更宽泛的环状脂肪酸芽抱杆菌会在两种培养基上生长出可见菌落。愈创木酚产生确证实验参见附录B。7.1.9结果观察具体见表1。表1确证试验结果分析阴性”见YSG7.1.10结果报告综合以上确证实验结果进行报告，报告结果如下：a)采用过滤方法检测的样品，报告10g样品中检出(或未检出)环状脂肪酸芽孢杆菌的数量；b)采用增菌方法检测的样品，报告10g样品中环状脂肪酸芽孢杆菌检测结果阳性(或阴性);c)采用直接涂平板方法检测的样品，报告0.01g样品中检出(或未检出)环状脂肪酸芽孢杆菌的数量。7.2终产品(果蓝汁、饮料等可直接消费产品)中环状脂肪酸芽孢杆菌的检测7.2.1预增菌加工(热处理)后直接取样的样品，无需再热体克处理，取整包装的成品置于45℃±1℃中预增菌7.2.2涂布平板无菌打开包装，取0.1mL增菌液分别涂布接种于K琼脂、YSG琼脂或BAT琼脂平板。各平板于45℃±1℃培养2d.如无菌生长，可延长至5d。7.2.4确证试验具体见7.1.8。7.3翅市商品中环状脂肪酸芽孢杆菌的检测7.3.1预增菌取整包装的成品置于45℃士1℃中预增菌7d。7.3.2涂布平板无菌打开包装，取0.1ml.样品液或增菌液分别涂布接种于K琼脂、YSG琼脂或BAT琼脂平板。假如无菌落生长，如果已怀疑腐败，但直接涂布平板未检出环状脂肪酸芽孢杆菌，应先预增菌和热休克处理后再进行检测。可取100ml.样品按5,1,2方法进行热处理，45℃±1℃培养后，接种于K琼脂、YSG琼脂或BAT琼脂平板。45℃±1℃培养2d,如无菌生长，可延长至5d。各平板于45℃±1℃培养2d,如无菌生长，可延长至5d。7.3.4确证试验具体见7.1.8。8试剂和材料除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。5氯化镁。氯化镁。8.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。8.2DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。8.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾，15mmol/1.下游；5'-GTGTTGCCGACTCTCGTG-3’8.5探针；5'-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’8.6TagDNA聚合酶。8.7dNTP₁dATP,dCTP,d8.8YSG液体培养基和BAT液体培养基(见附录A.3和附录A.5)8.9脂环酸芽孢杆菌质控菌株：ATCC49025。9检测程序见图2。图2荧光PCR方法检测脂环酸芽孢杆菌程序图10.1取样和增菌取样前消毒试样包装的开启处和取样工具。以无菌操作取试样10mL(g),加在90mL的YSG或BAT液体培养基中，振摇使试样充分混合后，45℃±1℃恒温振荡培养24h～48h。10.2模板DNA制备取增菌液1ml.加到1.5ml.无菌离心管中，8000r/min离心5min,尽量吸弃上清液；加入50μl.DNA提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取),混合后沸水浴5min,12000r/min离心5min,取上清液以待检测(必要时测定DNA的浓度和纯度，如不能及时检验，可将上清液于-20℃保存)。也可按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。反应体系总体积为25pL,其中含：10×PCR缓冲液2.5pL,引物(10gmol/L)各1pl.,探针7吐温80将上述成分混合，加入11.去离子水。121℃高压灭菌15min。冷却至50℃,用25%苹果酸调节pH值至3.7。将上述成分混合，加入1L去离子水。121℃高压灭菌15min。冷却至50℃,用1N盐酸调节pH成分同YSG琼脂培养基，但不包括琼脂。调节pH值后再121℃高压灭菌15min。a)CaCl₂·2H₂OKH₂PO₄8酵母提取物葡萄糖痕量矿物质溶液去离子水500mL用1NH₂SO₄或者1NNaOH调节pH值至4.0。121℃高压灭菌15min后冷却至150℃。痕量矿物质溶液NaMoO₁·2H₂O去离子水去离子水121℃高压灭菌15min后冷却至50℃。值至4,0,倒平板，无菌等体积混合a)和b),必要时调节pH值至4,0,倒平板，成分同BAT琼脂培养基，但不包括琼脂。调节pH值后再121℃高压灭菌15min。(资料性附录)愈创木酚产生确证试验——过氧化物酶方法从45℃培养的YSG琼脂板上分离可疑菌落，通过该试验确定从香草醛酸中产生愈创木酚的能力。本试验根据该菌和过氧化物酶反应后在YSG-香草醛酸培养基上的颜色反应进行结果判定。过氧化物A.herburius和其他几个种产生阳性结果。但并不是所有的环状脂肪酸芽孢杆菌菌株均有产生愈创木酚的能力，试验结果会随着接种量和菌种进行变化。因此，在试验过程中需分别设置阳性对照和阴性对照如A.acidwterrestris,A,atidaraldarius与被测分离物在同等条件下进行测试。从YSG平板上选择5~10个菌落置于含有100mg/kg香草酸的YSG肉汤中(YSGVA肉汤),混匀。接种阳性对照菌与阴性对照菌于YSGVA中，混匀。培养两个YSGVA肉汤，一个用来作空白对照，一个用作愈创木酚对照。将所有肉汤于45℃±1℃水溶锅中摇菌，最少3h,从水溶锅中取出。按附录2要求加入各种试剂。记录过氧化物酶试验结果阳性或阴性。如果结果不确定，加大接种量或延长培养时间重新进行检测。B.2.1接种5～10个测试菌落于含有100×10°香草醛酸的1mLYSG肉汤(YSGA)中。B.2.2接种阳性对照菌(A.acidoterrestri)和阴性对照菌(A.acidoraldarius)。另两个YSGVA肉汤管，分别用作空白对照和愈创木酚对照。B.2.3所有管置于45℃±1℃水浴解中进行摇菌。最少3h。B.3.1从水浴锅中取出所有管。B.3.2加100gL提供的愈创木酚溶液于愈创木酚对照管中。B.3.3各管中加入1ml.磷酸盐缓冲液(试剂1)。B.3.4加入20μL的H₂O₂(试剂2)