深低温冻存肝细胞癌样本的核糖核酸质量控制研究

深低温冻存肝细胞癌样本的核糖核酸质量控制研究[摘要]目的探索上海东方肝胆外科医院肝癌样本库低温冻存0～10年肝细胞癌样本的核糖核酸的质量。方法随机抽取2008年至2017年间库存手术切除肝细胞癌标本30份。1％琼脂糖凝胶电泳和RIN值评估法检测RNA完整性。结果将组织标本按冻存年限分成4组(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，各组间的RNA浓度无显著性差异(P>0.05)，各组之间A260/A280差异无统计学意义(P>0.05)，四组之间的RIN值检测显示，冻存5年以上组的RIN值有明显下降(P<0.05)。结论长期低温时间超过5年后的肝细胞癌患者的肿瘤标本RNA存在严重的降解。[关键词]生物样本；肝细胞癌；低温保存；核糖核酸；质量控制；前言肿瘤分子生物学与转化医学研究对高质量新鲜肿瘤标本的需求日益增长，生物样本库建设是后基因组时代的重要课题。全球范围内各研究机构建立有较为完善的肿瘤生物标本库ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Barry,2003#10"1-5)，不仅为肿瘤基础与临床研究提供重要的标本，并在核酸与蛋白质的提取、分析和建立肿瘤细胞系方面取得成果ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Bao,2013#16"6-8)。上海市东方肝胆外科医院肝癌样本库自2008年起开展肝癌生物样本库建设，在阐明肝癌发生的分子机制上提供了大量有价值的生物样本ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Yu,2018#17"9-15)。目前，有较大比例生物样本保存时间已经长达10年之久。为分析长期冷冻保存肿瘤样本是否适合分子生物学实验，本文探讨了低温样本库的储存年限与核糖核酸的分子完整性关系，以期为高质量生物样本库建设以及肿瘤转化医学研究提供参考。1材料与方法肝细胞癌样本随机抽取上海市东方肝胆外科医院肝癌样本库中2008年至2017年间库存手术切除肝细胞癌肿瘤标本30份。所有样本均为我院肝癌外科资深医师行肝癌根治术切取的肝癌标本，标本离体后30min内取材、分装在低温冻存管后投于液氮内，然后转入-80℃深低温冰箱保存。低温冻存时间在0至10年不等。样本编号T代表肝细胞癌组织。所有患者术前均未接受放化疗。标本编号与储存时间的对应关系见表1。表1：标本编号与低温储存时间的对应关系储存年份组织样本储存时间(年）T(肿瘤组织)200808-1T﹑08-2T﹑08-3T10200909-1T﹑09-2T﹑09-3T9201010-1T﹑10-2T﹑10-3T8201111-1T﹑11-2T﹑11-3T7201212-1T﹑12-2T﹑12-3T7201313-1T﹑13-2T﹑13-3T5201414-1T﹑14-2T﹑14-3T4201515-1T﹑15-2T﹑15-3T3201616-1T﹑16-2T﹑16-3T2201717-1T﹑17-2T﹑17-3T1样本中肿瘤细胞含量评估上海市东方肝胆外科医院肝癌样本库所有组织均同时留存一份于10％中性福尔马林固定、石蜡包埋后制备组织切片，由本院拥有5年以上经验的病理医师进行肿瘤组织学分类以及肿瘤细胞含量评估，本研究所有样本的肿瘤细胞含量均大于60％。

核糖核酸抽提与质控RNA抽提采用Trizol(宝生,大连,中国)抽提法。分光光度计测定A260/A280比值，1％琼脂糖凝胶电泳测量28S和18S核糖体RNA条带。RNA上样量为4ul，电泳时间30min，于凝胶图像分析仪观察电泳条带；Agilent2100生物分析仪测量RNA完整数值(RNAintegritynumber，RIN)。统计学方法所有实验数据应用SPSS13.0统计软件分析。RNA的浓度、A260/A280比值、RIN值采用单向ANOVA检验。组间构成比采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1

长期低温时间对样本抽提RNA浓度影响首先采用检测了不同低温保存年限的RNA浓度(ng/μL)。将组织标本按照低温冻存年限分成四组，分别为<2年、3-5年、6-8年和>9年，四组肝癌组织的RNA浓度分别为724.4±50.9﹑691.4±42.5﹑717.5±35.6﹑和618.5±34.5，各组之间RNA浓度没有显著性差异(图1，F=1.111，P=0.363)。可见，长期低温冻存对肿瘤组织样本RNA浓度无影响。2.2

长期低温时间对样本抽提A260/A280影响将组织标本按年限分成四组，分别为<2年、3-5年、6-8年、>9年，统计分析了四组间A260/A280差异，四组肿瘤的A260/A280比值分别为1.91±0.05﹑1.90±0.04﹑1.90±0.03﹑和1.93±0.04187,各组之间没有显著性差异(图2，F=0.143，P=0.933)。可见，长期低温冻存对肿瘤组织样本A260/A280无影响。2.3长期低温时间样本对抽提RNARIN影响接下来比较了四组之间RIN值差异，将组织标本按年限分成四组，分别为<2年、3-5年、6-8年、>9年，四组肿瘤的RIN值分别为8.38±0.56﹑7.78±0.36﹑5.78±0.48﹑和4.23±0.34，如图3所示，<2年和3-5年两组RIN值无差别(F=0.983，P=0.340)；6-8年组RIN值比较3-5年组RIN值有明显下降(F=10.860，P=0.005)；>9年RIN值比较6-8年组有明显下降(F=5.399，P=0.037)。提示冻存时间超过5年的标本RNA质量成逐年下降趋势。2.4RNA分子完整性及质量分级依照在1％琼脂糖凝胶电泳图上28S与18S条带情况以及RIN值将样本RNA质量与完整性分为A,B,和C3级。在1％琼脂糖凝胶电泳图上有清晰的28S与18S两条主带且RIN大于7定义为A，若能看到两条带但清晰度下降且28S条带模糊定义为B且RIN值大于4定义为B，若28S与18S两条带均消失呈涂抹状或RIN值小于4则定义为C。本组样本RNA分子的质控检测与储存年限关系见表2。本研究组将组织标本按年限分成四组，分别为<2年、3-5年、6-8年、>9年，各个A、B、C级样本数目之比为5:1:0、6:3:0、1:6:2和0:3:3，经统计学分析提示样本低温冻存5年以内A、B、C级样本数目之比无明显差异(P=0.604)，A、B、C级样本数目比例在低温冻存>9年组和3-5年组比较存在差异(P=0.013)；样本低温冻存6-8年，A、B、C级样本数目比例比较3-5年组也存在差异(P=0.037)；但是样本低温冻存6-8年与低温冻存>9年组A、B、C级样本数目比例无差异(P=0.435)。提示冻存时间超过5年的标本RNA提取高质量样本的数目锐减。3讨论肿瘤生物样本库的核心是温度与质量，国际上在样本核酸质量分析中，A260，A280及其比值是判断RNA样本纯度的指标；RNA的完整性可用琼脂糖凝胶电泳测量28S和18S核糖体RNA(rRNA)条带法和RIN值检测法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Schroeder,2006#8"16)。A260代表核酸(RNA)吸光度，A280代表蛋白质吸光度。纯净的RNA其A260/A280比值为1.7～2.0，比值<1.7表明有蛋白质或酚类污染，比值>2.0表明可能有异硫氰酸胍残留。对于RNA完整性的评价目前主要有两种方法，包括琼脂糖凝胶电泳测量28S和18S核糖体RNA(rRNA)条带法和RIN值检测法。rRNA占整个RNA分子的80％，而mRNA仅占RNA分子的3％，故检测mRNA并不容易，而检测含量高的rRNA相对容易。在琼脂糖凝胶电泳中，当28S和18S的rRNA条带亮度比例为2时便被认为RNA完整。RNA是极易降解的生物分子，由于缺血、凋亡及坏死等影响，28S的rRNA比18S的rRNA更易退化，所以28S和18S的比值为2难以实现。RIN的计算采用了“RIN软件算法”，检测结果以1到10数字表示，完整的RNA为10。根据现有实验报道，RIN值>7可视为优秀，适用于高质量的RNA研究，如基因芯片检测；RIN值为4～7视为良好，可以用于一般分子生物学研究，如定量PCR；当RNA完全降解时RIN值为1ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(\o"Jeffries,2014#6"17,\o"Morrissy,2012#7"18)。自RIN检测方法开发以来，被广泛用来评价RNA完整性。有文献提出，对于有一定程度RNA降解的样本，也可以进行定量PCR检测获得目的基因的相对表达量，从而提高了一批珍稀样本利用率。在本研究中，我们依照冻存年限将组织标本分成4组(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，研究结果提示各组间的RNA浓度无显著性差异(P>0.05)，各组之间A260/A280差异无统计学意义(P>0.05)，四组之间的RIN值检测显示，冻存5年以上组的RIN值有明显下降(P=0.018)。高质量的A级别RNA质量在冻存5年以上组所占比例开始降低，由此提示长期低温时间超过5年后的肝细胞癌患者的肿瘤标本RNA存在严重的降解。本研究不足之处在于仅对肝癌组织样本RNA质量进行评估，缺乏对癌旁组织和正常肝组织样本RNA质量评估，我们将在接下来的研究中进一步深入探讨。[参考文献]ADDINEN.REFLIST1. BarryW.NationaltumorbanksetupinUnitedkingdom.JournaloftheNationalCancerInstitute.2003;95(10):706.2. HuilingL,YuanQ,XinZ,XinX,DongjiangL,WeiW,etal.Establishmentofalungcancerbiobankofasouthernchinesepopulation.JournalofThoracicDisease.2009;1(1):17-22.3. MatzkeEA,O'DonoghueS,BarnesRO,DaudtH,CheahS,SuggittA,etal.Certificationforbiobanks:theprogramdevelopedbytheCanadianTumourRepositoryNetwork(CTRNet).Biopreservation&Biobanking.2012;10(5):426.4. RiegmanPHJ,DinjensWNM,OomenMHA,SpatzA,.,RatcliffeC,.,KnoxK,.,etal.TuBaFrost1:UnitinglocalfrozentumourbanksintoaEuropeannetwork:anoverview.EuropeanJournalofCancer.2006;42(16):2678-83.5. VaughtJ,RogersJ,MyersK,LimMD,LockhartN,MooreH,etal.AnNCIPerspectiveonCreatingSustainableBiospecimenResources.JNatlCancerInstMonogr.2011;2011(42):1-7.6. Bao,Wei-Guang,Zhang,Xia,Zhang,Jian-Gang,etal.BiobankingofFresh-frozenHumanColonTissues:ImpactofTissueEx-vivo;IschemiaTimesandStoragePeriodsonRNAQuality.AnnalsofSurgicalOncology.2013;20(5):1737-44.7. TroyerD.Biorepositorystandardsandprotocolsforcollecting,processing,andstoringhumantissues.MethodsinMolecularBiology.2008;441:193.8. ZhuZG,YuYY.Significanceofbiologicalresourcecollectionandtumortissuebankcreation.WorldJGastrointestOncol.2010;2(1):5-8.9. YuJ,XuQG,WangZG,YangY,ZhangL,MaJZ,etal.CircularRNAcSMARCA5inhibitsgrowthandmetastasisinhepatocellularcarcinoma.JournalofHepatology.2018;68(6).10. YuanJH,YangF,WangF,MaJZ,GuoYJ,TaoQF,etal.AlongnoncodingRNAactivatedbyTGF-betapromotestheinvasion-metastasiscascadeinhepatocellularcarcinoma.Cancercell.2014;25(5):666-81.11. YuanSX,WangJ,YangF,TaoQF,ZhangJ,WangLL,etal.LongnoncodingRNADANCRincreasesstemnessfeaturesofhepatocellularcarcinomabyderepressionofCTNNB1.Hepatology.2016;63(2):499-511.12. LiuF,YuanJ,Lt,HuangJ,YangF,WangT,etal.LongnoncodingRNAFTXinhibitshepatocellularcarcinomaproliferationandmetastasisbybindingMCM2andmiR-374a.Oncogene.2016;35(41):5422.13. XuQG,YuanSX,TaoQF,YuJ,CaiJ,YangY,etal.AnovelHBxgenotypeservesasapreoperativepredictorandfailstoactivatetheJAK1/STATspathwayinhepatocellularcarcinoma.JHepatol.2019.14. FangW,Ji-HangY,Shao-BingW,FuY,Sheng-XianY,ChenY,etal.OncofetallongnoncodingRNAPVT1promotesproliferationandstemcell-likepropertyofhepatocellularcarcinomacellsbystabilizingNOP2.Hepatology.2014;60(4):1278–90.15. ZhouCC,YangF,YuanSX,MaJZ,LiuF,YuanJH,etal.SystemicgenomescreeningidentifiestheoutcomeassociatedfocallossoflongnoncodingRNAPRALinhepatocellularcarcinoma.Hepatology.2016;63(3):850-63.16. SchroederA,MuellerO,StockerS,SalowskyR,LeiberM,GassmannM,etal.TheRIN:anRNAintegritynumberforassigningintegrityvaluestoRNAmeasurements.BMCmolecularbiology.2006;7:3.