生物制药工艺学课件

生物药物概述

化学药物、生物药物与中草药是人类防病、治病的三大药源。

一、概念：

1、

生物药物——是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品。

2、

广义的生物药物——包括从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。

由于抗生素发展迅速，已成为制药工业的独立门类，所以生物药物主要包括生化药品与生物制品及其相关的生物医药产品（biologicalmedicinalproducts）。第一节生物药物的研究范围

一、生物药物的历史与现状我国应用生物材料作为治疗药物的最早者为神农,11世纪沈括所著的《沈存中良方》中人类用生物材料分离产品作为生理功能调节剂，中国人所创始。明代李时珍《本草纲目》所载药物1892种，除植物药外，还有动物药444种（其中鱼类63种、兽类123种、鸟类77种、蚧类45种、昆虫百余种）。书中还详述了入药的人体代谢物、分泌物及排泄物等1、生化药物：早期的生物药物多数来自动物脏器，有效成分也不明确，曾有脏器制剂之称。

二十世纪20年代，对动物脏器的有效成分逐渐有所了解。纯化胰岛素、甲状腺素、各种必需氨基酸、必需脂肪酸、以及多种维生素开始用于临床或保健。

50年代起开始应用发酵法生产氨基酸类药物，到90年代初，已有生化药物500多种，还有100多种临床诊断试剂。

截止到2000年2月，美国FDA已批准生物技术药物76个，欧美已批准的有84种。

2、生物制品：早在10世纪，我国民间就有种牛痘预防天花的实践。所谓种牛痘就是用降低了毒力的天花病毒接种到人体上，引起轻型感染。

1796年英国医生琴纳发明了预防天花的牛痘苗，从此用生物制品预防传染病的方法才得到肯定。

30年代中期建立了小鼠和鸡胚培养病毒的方法，从而用小鼠脑组织或鸡胚制成黄热病、流感、乙型脑炎、森林脑炎和斑疹伤寒等疫苗。

50年代，在离体细胞培养物中繁殖病毒的技术取得突破，从而研制成功小儿麻痹、麻疹、腮腺炎等新疫苗。

80年代后期，应用基因工程技术己研制成功乙肝疫苗、狂犬病疫苗、口蹄病疫苗和AIDS病疫苗。预计基因工程疫苗的品种将会迅速增多。同时各种免疫诊断制品和治疗用生物制品也迅速发展。3、生物技术药物：自1982年人胰岛素成为用DNA重组技术生产的第一个生物医药产品以来，以基因重组为核心的生物技术所开发研究的新药数目一直居首位。此外，应用酶工程技术、细胞工程技术和基因工程技术生产抗生素、氨基酸和植物次生代谢产物也已步入产业化阶段。4、

生物工程在医药上的开发应用生物技术是应用基因工程（含蛋白质工程）、细胞工程、发酵工程和酶工程，以生物体为依托发展各种生物产业的技术，现在所称的生物技术是以基因工程为核心以及具备基因工和细胞工程内涵的发酵工程和酶工程，以区别于传统的生物技术。生物技术作为高技术领域之一，已经越来越为人们所重视。

自七十年代初，以DNA重组技术和淋巴细胞杂交瘤技术的发明和应用为标志，生物技术诞生了。

由于生物技术对解决人类面临的重大问题如：粮食、健康、环境、能源等将开辟广阔的前景，所以各国政府竟相制定发展计划，国家实行优惠政策，政府和企业界巨资投入，促进生物技术的发展。尤其是在医药领域。随着生物技术的不断发展、人类基因组计划的实施、利用转基因动植物生产贵重药品、基因治疗、动物克隆技术的发展、生物芯片的研制、胚胎干细胞的美好应用前景等在医学上的开发应用，必将对医学产生全面、深远和革命性的影响。

1995年底，美国药品研究与制造者协会（PRMA）调查统计，美国已批准上市的共有24种基因工程药品和疫苗。1997年7月已达到40种。年产值约100亿美元左右。还有100多种基因工程药物已进入临床试验阶段。全球拥有数十个年销售额在10亿美元左右的基因工程产品。我国基因工程制药产业是在80年代末开始的。

1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素α1b，这是我国自主研制成功的拥有自主知识产权的第一个基因工程新药。从此以后，我国基因工程药物的研究开发迅速发展。

据统计，截止到1998年底，我国已批准的基因工程药品和疫苗产品约15种目前我国已批准上市的基因工程新药21种，已批准的进口基因工程药品19种。

二、生物制药工艺学的性质与任务（一）概念：

1、《生物制药工艺学》——是从事各种生物药物的研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。

研究内容包括生化制药工艺、生物制品制造与相关的生物医药产品的生产工艺。主要讨论各类生物药物的来源、结构、性质、制造原理、工艺过程、生产技术操作和质量控制。所以《生物制药工艺学》是一门理论与实践紧密结合的崭新的综合性制药工艺学。

2、生化药物——是运用生物化学的理论、方法和研究成果，从生物体分离、纯化得到的一些重要生理活性物质，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶与辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物等

所以现代生化理论、免疫学、发酵工艺学、生化分离、纯化技术、工业药剂学等与生物制药工艺学的关系极为密切。也可以说，《生物制药工艺学》是以这些学科为基础发展起来的一门综合性技术科学。

3、生物制品——用微生物及微生物代谢产物或动物血清制成的用于预防、诊断和治疗的制品。⑴狭义的疫苗亦称为病毒性疫苗，是用减毒的活病毒或立克次体及灭活的强毒病毒或立克次体制备的一类用于自动免疫的生物制品。⑵广义的疫苗包括病毒性疫苗、细菌性疫苗（菌苗）和类毒素等由微生物所制备的用于自动免疫的生物制品。

生物制品的定义暂时称之为用生物学方法（包括基因工程方法）和生化方法制成的，具有免疫学反应或平衡生理作用的药物制剂。

生物制药工艺学是一门新型的现代制药工艺学。具体任务是讨论：

①生物药物的来源及其原料药物生产的主要途径和工艺过程；

②生物药物的一般提取、分离、纯化、制造原理与生产方法；

③各类生物药物的结构、性质、用途及其工艺过程和质量控制。

第二节生物药物的性质和分类一、生物药物的特点

新陈代谢是生命的基本特征之一，生物体是有组织的统一整体。生物体的组成物质及其在体内进行的一连串代谢过程都是相互联系、相互制约的。

1、所谓疾病——主要是机体受到内外环境的改变而使代谢失常，导致起调控作用的酶、激素及核酸、蛋白质等生物活性物质自身或环境发生障碍。

2

根据其构效关系进行结构的修饰和改造使之更有效、更专一、更合理地为机体所接受。在机体需要时（如生病时），应用这些活性物质作为药物来补充调整、增强、抑制、替换或纠正人体的代谢失调，势必比较地有效和合理。所以生物药物在医疗上具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小、疗效可靠及营养价值高等特点。

生物药物对热、酸、碱、重金属及pH变化和各种理化因素都较敏感，生物材料又易腐败、染菌、被微生物的活动所分解或被自身的代谢酶所破坏，甚至机械搅拌、压片机冲头的压力、金属器械、空气、日光等对生物活性都会发生影响。为此，要确保生物药物的有效药理作用，就要从原料制造、工艺过程、制剂、贮存、运输和使用各个环节严加控制。为了保证全部制品的质量，必须有严格的制造管理要求，即优质产品规范（goodmanufacturingpractics），简称GMP质量管理要求，并对制品的有效期，贮存条件和使用方法做出明确规定。

尤其对有效成分的检测，除应用一般化学方法外，更应根据制品的特异生理效应或专一生化反应拟定其生物活性检测方法。通常采用一个国际上认可的标准品作为测试时的参考标准。这种标准品在国际上有统一规定的制法和规格，依照这样规定的制法和规格，就可以复制成相应的副品，供有关生产单位使用。有关国际专业组织曾公布和制定了一些主要激素类药物的标准品。鉴于生物药物多数是生物活性分子,其化学性质与生物学性质都很不稳定，在生产过程中又易受到微生物污染，从其他生物体制取的生物药物对人体往往是异源物质，所以对制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等都有严格的要求。

其制造工艺设计与质量标准的制定也就与一般化学药物有较多区别。根据中华人民共和国卫生部制定发布的《新药审批办法》规定，新药研究内容应包括工艺路线、质量标准、临床前药理及临床研究，同时，必须研究该药的物理、化学性能、纯度及检验方法、药理、毒理、动物药代动力学、临床药理、处方、剂量、剂型、生物利用度、稳定性等并提出药品质量标准草案。同时强调注射用生化制品还应进行热原、异性蛋白及过敏试验，一般不必进行特殊毒理研究（三致试验：致突变、致癌和致畸试验）。

对新生物制品的研究内容应包括选种、生产方法和工艺路线、质量标准、人体观察或临床试验。应对菌种的抗原性、免疫原性、毒性，基因的稳定性、生产工艺和生产条件，制品的安全性、有效性、稳定性、保存条件及有关生物学、理化学、免疫学、检定方法和质量标准进行研究，并提出制造及检定规程和使用说明书草案。二、生物药物的分类生物药物可以按其生理功能和临床用途分类，还可以按其来源和制造方法进行分类，但通常是按其化学本质和化学特征进行分类。（一）生化药物生化药物的有效成分和化学本质多数己比较清楚，故一般按其化学本质和药理作用进行分类和命名。1、氨基酸类药物全世界的氨基酸总产量已逾百万吨／年。年产值达几十亿美元。应用于医药、食品、饲料工业，还供合成高效无残毒农药及甜味剂。

⑴

氨基酸类药物有个别氨基酸制剂和复方氨基酸制剂两类。2、多肽和蛋白质类药物

⑴活性多肽是由多种氨基酸按一定顺序连接起来的多肽链化合物，分子量一般较小，多数无特定空间构象。最近发现，某些多肽也有一定构象，只是其构象的坚固性远不如蛋白质，其特点是构象的浮动性很大，有时甚至在几种构象中进行摆动或在发挥某种生物功能时才出现某种构象。

⑵蛋白质类药物有单纯蛋白质与结合蛋白类（包括糖蛋白、脂蛋白、色蛋白等）。

3、酶与辅酶类药物

酶制剂也广泛用于疾病的诊断和治疗。在制药工业、轻工食品和农业方面酶制剂的使用种类和数量也十分可观。酶类药物有下列几类：（1）助消化酶类（2）消炎酶类（3）心血管疾病治疗酶（4）抗肿瘤酶类（5）其它酶类超氧化物歧化酶（SOD）用于治疗类风湿性关节炎和放射病PEG—腺苷脱氨酶（PEG—AdenaseBovine）用于治疗严重的联合免疫缺陷症。（6）辅酶类药物

辅酶或辅基在酶促反应中起着递氢，递电子或基因转移作用，对酶的催化作用的化学反应方式起着关键性决定作用。多种酶的辅酶或辅基成分具有医疗价值。4、核酸及其降解物和衍生物

（1）核酸类

免疫RNA（iRNA）是一种高度特异性的免疫触发剂，可用于肿瘤的免疫治疗。（2）多聚核苷酸多聚胞苷酸、多聚次黄苷酸、双链聚肌胞（polyI：C），聚肌苷酸及巯基聚胞苷酸是干扰素诱导剂，具有刺激吞噬作用，调整免疫功能的作用，用于抗病毒、抗肿瘤。（3）核苷、核苷酸及其衍生物较为重要的核苷酸类药物有混合核苷酸、混合脱氧核苷酸注射液、

经人工化学修饰的核苷酸、核苷或其碱基衍生物是有效的核酸抗代谢物，常用于治疗肿瘤和病毒感染。

5、多糖类药物多糖类药物的来源有动物、植物、微生物和海洋生物，它们在抗凝、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能和抗衰老方面具有较强的药理作用。

6、脂类药物脂类药物包括许多非水溶性的、能溶于有机溶剂的小分子生理活性物质，主要有：（1）磷脂类脑磷脂、卵磷脂多用于肝病、冠心病和神经衰弱症。（2）多价不饱和脂肪酸和前列腺素。（3）胆酸类（4）固醇类（5）卟啉类7、细胞生长因子与组织制剂细胞生长因子是在体内对动物细胞的生长有调节作用，并在靶细胞上具有特异受体的一类物质。它们不是细胞生长的营养成分。已发现的细胞生长因子均为多肽或蛋白质。

（二）生物制品生物制品有预防用制品、治疗用制品和诊断用制品。

预防用制品可分为菌苗（如卡介苗、霍乱菌苗、百日咳菌苗、鼠疫菌苗等）、疫苗（如乙肝疫苗、流感疫苗、乙型脑炎疫苗、狂犬疫苗、痘苗、斑疹伤寒疫苗等）及类毒素（如白喉类毒素、破伤风类毒素）。治疗用制品有特异性治疗用品与非特异性治疗用品诊断用制品主要指免疫诊断用品，如结核菌素、锡克试验毒素及多种诊断用单克隆抗体等。

随着生物科学的迅速发展，生物制品在品种上从原来的疫苗发展到菌苗和类毒素等，性质上从减毒活苗发展到灭活疫苗和死菌苗，并由自动免疫制剂发展到抗毒素等被动免疫制剂，用途上从预防制剂发展到治疗和诊断制剂。由于基因工程的发展，生物制品也不再只限于来自天然材料加工而成的产品，尚可来自人工合成的化合物。应用范围也不局限于传染病等，例如对肿瘤的诊断与治疗等也有不少新品种的诞生与应用。三、生物药物的用途（－）作为治疗药物对许多常见病和多发病，生物药物都有较好的疗效。（二）作为预防药物以预防为主的方针是我国医疗卫生工作的一项重要战略。许多疾病，尤其是传染病（如细菌性和病毒性传染病）的预防比治疗更为重要。通过预防，许多传染病得以控制，直到根绝。（三）作为诊断药物生物药物用作诊断试剂是其最突出又独特的另一临床用途，绝大部分临床诊断试剂都来自生物药物。诊断用药有体内（注射）和体外（试管）二大使用途径。（1）免疫诊断试剂利用高度特异性和敏感性的抗原抗体反应，检测样品中有无相应的抗原或抗体。（2）酶诊断试剂利用酶反应的专一性和快速灵敏的特点，定量测定体液内的某一成分变化作为病情诊断的参考。（3）器官功能诊断药物利用某些药物对器官功能的刺激作用、排泄速度或味觉等以检查器官的功能损害程度。（4）放射性核素诊断药物放射性核素诊断药物有聚集于不同组织或器官的特性，故进入体内后，可检测其在体内的吸收、分布、转运，利用及排泄等情况，从而显出器官功能及其形态，以供疾病的诊断。（5）诊断用单克隆抗体（McAb）McAb的特点之一是专一性强，一个B细胞所产生的抗体只针对抗原分子上的一个特异抗原决定簇。（四）用作其它生物医药用品生物药物应用的另一个重要发展趋势就是渗入到生化试制、生物医学材料，营养、食品及日用化工，保健品和化妆品等各个领域。（l）生化试剂生化试剂品种繁多，如细胞培养剂，细菌培养剂，电泳与层析配套试剂，DNA重组用的一系列工具酶、植物血凝素，同位素标记试剂和各种抗血清与免疫试剂等。（2）生物医学材料主要是用于器官的修复、移植或外科手术矫形及创伤治疗等的一些生物材料。（3）营养保健品及美容化妆品这类药物已渗入到广大人民的日常生活中，前景可观。第三节生物药物的研究发展趋势

20多年来，生物药物的研究开发取得了巨大进展。新的生理活性物质不断发现，原有药物在医疗上的用途又有新的认识和评价；药物新剂型日益增多；生物技术普遍进入实验室；生物工程药物迅速步入产业化。专家预见，许多医学上的疑难杂症将在此突破，将导致产生全新的制药工业技术体系，许多原先无法生产的药物将用生物技术生产，从而促使医药产品更新换代。一、资源的综合利用与扩大开发开展综合利用，由同一资源生产多种有效成分，达到一物多用，充分、合理地利用生物资源，不仅可以降低成本，而且可以减少三废，提高药品纯度，减少副作用。

（－）脏器综合利用（二）血液综合利用

人血含有性质和功能不同的多种成分。大多数病人只需要一种成分，很少需要多种成分。因此最好的办法是分离出各种成分，分别对症使用，既可提高疗效减少副作用，又可充分利用宝贵血源。（三）人尿综合利用人尿是来源丰富的宝贵生物资源。由人尿制取的药物与人体成分同源，不存在异种蛋白抗原性问题。不同生理时期的尿液，所含活性成分有较大不同。（四）扩大开发新资源近几年，新资源开发不断扩大，促使新药研究向纵深发展。如海洋生物、昆虫、毒蛇和低等生物（如藻类等）。

二、大力发展现代生物技术医药产品

生物技术应用于制药工业，不仅可以生产出大量廉价的防治人类重大疾病的新型药物，而且将引起制药工业技术的重大变革。医药工业是生物技术研究开发最活跃，进展最快的一个产业。主要研究开发：①生理活性物质，②干扰素，③抗体，④疫苗，⑤抗生素，⑥维生素，⑦医疗诊断用品，⑧其它药品。从事研究的技术领域有发酵技术，基因重组技术，蛋白质工程技术，细胞融合技术，动植物细胞大量培养技术，生物反应器与生化工程设备技术。三、依靠生化理论从天然存在的生理活性物质寻找新药己发现的作为药用的生理活性物质仅是机体内存在的活性物质的一小部分，许多新的活性物质正待人们去开发，所以进一步研究尚未发现的新物质和过去不认识的生理作用是寻找新药的另一个重要方向。四、发展化学合成和蛋白质工程创制新结构药物许多结构较为简单或分子量不太大的天然活性物质已可以通过化学合成生产或结构改造形成新化合物。

蛋白质工程是“从头设计”以获得人工蛋白质的新技术。它包括蛋白质的化学修饰、合成以及在第一代基因工程基础上发展起来的第二代基因工程。第二代基因工程是根据蛋白质的结构与功能的研究结果，通过修饰或改造编码目的蛋白的DNA序列，与基因克隆技术相结合，从而获得自然界不存在的新型蛋白质分子。（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝脏（维生素、磷脂类、胆固醇）（5）脾脏（免疫器官）（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）（7）脑垂体（各种激素）（8)心脏（细胞色素C、辅酶Q10）其它等（二）血液、分泌物和其它代谢物血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生长因子、HCG（三）海洋生物（1）海藻（2）腔肠动物海葵毒素（3）节肢动物甲壳素（4)软体动物多糖、多肽、毒素（5）棘皮动物海星、海胆、海参海参素抗癌（6）鱼类鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7）爬行动物龟滋阴养肾抗肿瘤（8）海洋哺乳动物鲸鱼鱼肝油（四）植物生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质等。（五）微生物1.细菌常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：（1）氨基酸利用微生物酶可转化对应的α酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。（2）有机酸柠檬酸、苹果酸、乳酸（3）糖类利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸类用细菌可生产5‘－AMP，5’－肌苷酸（5）维生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶2.放线菌放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。（1）氨基酸发酵法（2）核苷酸5-脱氧肌苷酸（3）维生素（4)酶3.真菌（1)酶（2）有机酸（3）氨基酸（4）核酸及有关物质（5）维生素（6)促生素（7）多糖4.酵母菌（1）维生素（2）蛋白质与多肽（3）核酸（六）开发生物新资源（1）动植物细胞的大规模培养（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞二、生物活性物质的存在方式（一）生物活性物质的存在方式与其生物功能根据生物活性物质的生物功能推断其存在部分和分布方式。生物活性物质分为胞内与胞外两种存在部位。（二）生物分子间的作用力三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性（二）生物活性物质存在地特点生物活性物质在生物材料中含量较低，杂质含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。生物材料中的生化组成数量大，种类多，分离纯化比较困难。四、生物材料的准备生物材料的制造主要包括以下工艺过程：

1)生物材料的选取与预处理；2)从生物材料中提取有效活性物质；3)有效成分的分离，纯化4)后处理及制剂（一）生物材料的选取1.有效成分的含量（1）生物品种根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）（2）合适的组织器官（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生长期生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。2.杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。3.来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。胰脏制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。（二）生物材料的采集与保存生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。（三）动物细胞的培养与保存（四）微生物菌种的选育与保存1.菌种的分离微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。（1）含菌样品的收集根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm，在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。（2）富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。（3）菌种纯化在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。2.菌种的筛选（1）筛选对象的选择筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。（2）培养方式的确定微生物的培养方式，有固体培养与液体培养。3.菌株的选育从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。（1）随机选择法一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。（2）根据代谢的调节机理选择高产突变体根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)4.菌种的保藏（1）菌种的退化与防止生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。退化—一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。菌种退化现象：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。

菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变。③制定科学管理制度制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；⑤选择培养条件选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。（2）常用的菌种保藏方法斜面保存法—将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。矿油法—在菌种斜面上覆盖矿物油以隔绝空气防止蒸发。索氏法—将小试管斜面的菌种放在大试管内，大试管内装几粒氢氧化钾，管口加橡皮套，然后用石蜡包封。干硅胶法—试管内装硅胶约半满，180℃加热灭菌1.5小时，置密封干燥器内冷却，接种菌液约1ml，塞好棉花，放入预置有色硅胶的大瓶中，蜡封瓶口，于低温处保存。砂土管法—取普通黄沙，洗净过60目筛，晒干，另取普通圆土研碎，过筛，晒干。两者以6:4混合。分装于安醅瓶或小试管中，然后在60℃干热灭菌2小时，连续灭菌三次后即可使用。装管时可吸取少许孢子悬浮液加入，待干燥后抽真空封口或用棉花塞紧后蜡封，低温保藏。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于－70~－80℃.（五）组织与细胞的破碎组织与细胞的破碎方法有物理法、化学法与生物法。1.物理法（1）磨切法工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。（2）压力法有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。（3）超声波法（4）反复冻融法2.化学法用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。3.生物法（1）组织自溶法利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。(2)酶解法用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等（3）噬菌体法用噬菌体感染细胞、裂解细胞，释放出内容物。（六）细胞器的分离为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。第二节生物活性物质的提取提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。一、物质性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。（二）活性物质的保护措施（1）采用缓冲盐系统在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。（2）添加保护剂防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，

－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。（3）抑制水解酶的作用（4）其它保护措施（冷、热、酸、碱）二、物质的性质与溶解度（一）物质溶解度的一般规律相似相溶（二）水在生化物质提取中的作用水是提取生化物质的常用溶剂。水分子的存在可使其它生物分子之间的氢键减弱，而与水分子形成氢键，水分子还能使溶质分子的离子键解离，这就是所谓的水合作用。水合作用促使蛋白质、核酸、多糖等生物大分子与水形成了水合分子或水合离子从而促使它们溶解于水或水溶液中。三、提取效率四、影响提取的因素（一）温度多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0~10℃进行提取。(二)酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在4～9范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。巧妙地选择溶剂系统的pH值不但直接影响目的物与杂质溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收率。（三）盐浓度盐溶作用盐析作用五、提取方法（一）用酸、碱、盐水溶液提取（二）表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。（三）有机溶剂提取1.固－液提取丙酮从动物脑中提取胆固醇，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。丙酮粉2.液－液萃取液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量溶剂萃取的注意事项：（1）pH

在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。（2）盐析加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（3）温度一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4）乳化在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。液液萃取时溶剂的选择：（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。(3)两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。第三节生物活性物质的浓缩与干燥一、生物活性物质的浓缩（一）盐析浓缩硫酸铵沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（四）用聚乙二醇透析浓缩（五）超滤浓缩（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有较大的表面积，热传播快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象。二、干燥干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。表面水，毛细管中的水，细胞内的水（一）减压干燥（二）喷雾干燥（三）冷冻干燥第四节生化物质的分离纯化方法一、生物制药中分离制备方法的特点生物制药中分离、制备方法有以下特点：（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（难点）（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。二、生物制药中分离制备方法的基本原理生物大分子分离纯化的主要原因：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离—亲和层析法。三、分离纯化的基本程序和实验设计生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。（3）材料处理及抽提方法的选择。（4）分离纯化方法的摸索。（5）产物均一性测定。提取是分离纯化目的物的第一步，所选的溶剂应对目的物具有最大的溶解度，并尽量减少杂质进入提取液。分离纯化是生化制备的核心操作。分离策略：1.分离纯化早期使用方法的选择分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高。2.各种分离纯化方法的使用程序生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。而每一种方法又都是在特定条件下发挥作用。因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。（盐析－吸附，吸附－盐析）对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。3.分离后期的保护性措施在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。对每一步骤方法的优劣，体现在所得产品重量与活性平衡关系上。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。五、制备物均一性的鉴定均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分。（纯度鉴定）生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。第五节生物制药中试放大工艺设计一、生物制药中试放大工艺特点中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。这些研究工作都是围绕如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。中试放大，验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：（1）原辅材料规格的过渡试验在小试时，一般采用的原辅材料（如原料，试剂，溶剂，纯化载体）规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证实验结果的准确性。但是当工艺路线确定之后，在进一步考察工艺条件时，应尽量改用大规模生产时容易得到的原辅材料。过渡试验2.设备选型与材质质量试验在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进行，但在工业生产中，物料要接触到各种设备材料，如微生物发酵罐，细胞培养罐，固定化生物反应器，多种层析材料以及产品后处理的过滤浓缩、结晶、干燥设备等。3.反应条件限度试验反应条件限度试验可以找到最适宜的工艺条件（如培养基种类，反应温度，压力，pH等），一般均有一个许可范围。有些反应对工艺条件要求很严，超过一定限度后，就会造成重大损失。进行工艺条件限度试验，全面掌握反应规律。4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究5.下游工艺的研究尽量简化下游工艺操作，采用新工艺，新技术，新设备等。二、中试放大方法与内容中试放大的方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。经验放大法主要凭借经验通过逐级放大（实验装置，中间装置，中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。中试放大程序可采用步步为营或一竿子到底策略。中试放大的研究内容主要有：（1）工艺路线与各步反应方法的最后确定（2）设备材质与型号的选择（3）反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查。（4）生产反应条件的研究（5）工艺流程与操作方法的确定第一节生物制药工艺的发展一、生物药物类型与品种的发展（一）生化药物1.治疗酶与诊断用酶（1）超氧化物歧化酶（SOD）抗炎、抗辐射、抗衰老（2）凝血酶（3）L－天冬酰胺酶（4）尿激酶（5）PEG－腺苷脱氨酶（治疗免疫缺陷症）（6）β－半乳糖苷酶（用于生产无糖牛奶）2.核苷和核苷酸类药物（1）叠氮脱氧胸苷（AZT）（治疗爱滋病）(2)丙氧鸟苷（DHPG）（抗病毒）3.多糖类药物（1）肝素钙与小分子量肝素（抗凝血）（2）透明质酸（化妆品，关节炎）4.蛋白质与多肽类药物（1）水蛭素（抗凝血，防血栓）（2）转移因子（如牛脾转移因子，胎盘转移因子等，免疫）（3）胸腺制剂（抗肝炎，免疫）（4）肝细胞生长因子（治疗肝炎）5.脂类药物（β－胡萝卜素，EPA，DHA）（二）基因工程药物（1）乙肝疫苗（2）人白细胞干扰素（IFN）（3）基因工程人胰岛素（4）人白细胞介素（IL－2）（5）人生长激素（hGH）（6）人组织纤溶酶原激活剂（htPA）（7）人促红细胞生成素（hEPO）（8）细胞集落刺激因子（CSFs）（三）细胞工程产品主要动物细胞培养产品有：α干扰素，γ干扰素，EPO，IL－2及尿激酶等；植物细胞培养产品：罗汉果，洋地黄，延胡索，人参，贝母，紫杉，紫草组织培养等。各种单克隆抗体。二、生化分离制备技术的发展（一）生物反应器生物反应器包括微生物细胞大规模培养的发酵罐和动物细胞大规模的培养罐及用于固定化酶或固定化细胞进行连续自动化转化生化物质的各种生物催化反应器。用于微生物细胞培养的生物反应器：

搅拌通气的反应器气升式反应器喷射自吸式反应器用于多糖及脂肪酶发酵生产的离心式生物反应器用于乳酸发酵的螺旋管式连续发酵连续培养光合细胞的反应器动物细胞培养器用于固定化酶或固定化细胞生物反应器采用固定床和沸腾床。（二）生物药物下游加工技术错流超滤，高效液相色谱，亲和色谱，色层层析等。快速蛋白液相色谱系统。（三）膜分离技术超滤技术，已用于酶发酵工业的纯化和浓缩。三、生物工程技术在生物制药工业中的应用（一）酶工程技术第一代酶—酶制剂第二代酶—固定化酶第三代酶—固定化多酶（包含辅因子再生系统）1.酶的固定化方法酶的固定化方法有下述4种：吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共价结合法交联法包埋法（1）吸附法吸附法分为物理吸附法与离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但吸着在载体上的酶，易于脱落，使用价值少。离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水不溶性载体结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。离子吸附法常用的载体有：1)阴离子树脂，如DEDA-C,ECTEOLA-纤维素，TEAE－纤维素，DEAE－葡聚糖凝胶，AmberliteCG－50,IRC－50,IR－120,IR－200,Dowex－50等。例：DEAE－SephadexA-25吸附氨基酰化酶（2）包埋法包埋法系将酶包埋于凝胶或高分子聚合物网格内，网格可以防止酶的渗出，底物仍能渗入网格内与酶相接触。包埋法的优点是酶分子本身不参与水不溶性网格的形成，许多酶都可用此法固定化。其操作简单，酶分子只是被保埋起来，而未受到化学反应，因此固定化酶表现活力较高。常用的报埋剂有聚丙烯酰胺，卡拉胶，淀粉凝胶，三醋酸纤维素，海藻酸，胶原，血纤维，大豆蛋白等。例：卡拉胶保埋细胞生产苹果酸（3）共价键结合法共价键结合法是通过化学反应使酶与聚合物载体共价偶联。酶与载体共价结合的功能团包括氨基，羧基，酚羟基，巯基，羟基，咪唑基。常用共价键结合法有：重氮化法，烷基化和芳基化法，戊二醛结合反应法，钛螯合法，硫醇－二硫化物的互换反应等。固定化糖化酶（4）肽键结合法该法主要将含羧基的水不溶性载体变成酰基叠氮，异氰酸盐，卤化物等衍生物，再使这些衍生物与酶的游离氨基进行反应，形成肽键。（5）交联法交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。由于酶蛋白的功能基团，如氨基，酚基，巯基，和咪唑基，参与交联反应，因此可能影响酶的活性中心结构，而使酶活力显著失活。交联剂有多种，主要为戊二醛。在固定化酶的基础上，固定化细胞技术得到迅速发展，其实际应用速度已超过固定化酶。固定化细胞具有更多的优点，它省去酶的分离操作。在细胞内，酶稳定性较高，进行固定化时，活力丧失较少，且能利用天然存在的多酶体系，制造成本更低。但是反应产物与底物必须容易透过细胞膜。2.酶工程技术的应用固定化酶和固定化细胞在食品发酵工业和制药工业方面的应用，不仅可以改革现有的生产工艺，而且可以创新多酶反应工艺，还可以促使发酵工业发生根本性变革，因此在制药工业中的应用具有很大潜力。（二）细胞培养技术1.动物细胞培养技术及其应用动物细胞的培养是将来自动物体的某些组织或器官，在模拟体内生理条件下，在体外进行培养，使之存活和生长。（1）动物细胞培养条件营养条件培养基（人工合成，半人工合成）pH条件7.2-7.4温度条件37±0.5℃气体条件O2和CO2渗透压无菌条件（2）培养方法体外培养细胞有原代培养与传代培养两种方法。原代培养法有单层培养法和组织块培养法。传代培养是将原代培养的细胞进行稀释分瓶继续培养。（3）动物细胞大批培养技术许多有价值得蛋白质，多肽制品都可以用动物细胞大规模培养技术进行生产，如病毒疫苗，干扰素，单克隆抗体等。因此动物细胞培养技术正向大型化，自动化和精巧化方向发展。①微载体培养系统微载体培养是细胞培养附着和生长在微载体表面。②气升式深层发酵罐法③中空纤维法④微囊法将活细胞悬浮在海藻酸钠中，滴入氯化钙溶液中，形成小珠，用长链氨基酸聚合物聚赖氨酸，形成多孔外膜，然后重新液化胶化小球，使成胶物质从多孔外膜流出，活细胞留在膜内，然后进行培养。（4）动物细胞培养技术的应用（人生长激素，乙型肝炎疫苗）2.植物细胞的培养及其应用（1）植物细胞的培养技术植物细胞培养是将植物体的某一部分经无菌处理后置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。用于进行培养所需的植物部分成为外殖体。所形成的脱分化的细胞团称为愈伤组织。将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养即为悬浮培养。培养基大量无机盐，植物激素等（2）植物组织培养的应用植物细胞培养技术有着广泛应用，尤其在天然药物的生产上具有广阔前景。如长春碱、地高辛，（三）单克隆抗体技术1.单克隆抗体的制备原理

B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决定族的特异性抗体，一个机体可产生多达100万种特异性的抗体。但是一个B细胞却只能分泌一种特异性抗体。例如，小鼠B细胞受乙肝病毒刺激后，可产生针对乙肝病毒的7种不同标志的特异性抗体，它们分别由7种小鼠B细胞产生。这些B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，形成7种杂交瘤细胞，稀释纯化，挑出单个杂交瘤细胞，进行无性繁殖（克隆）。同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合并分泌的特异性抗体质地均一，这种抗体称之为单克隆抗体。2.单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。（1）杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养罐，微囊发酵罐培养基：牛淋巴液，血清（2）单抗的分离纯化（超滤、盐析、离子交换、HPLC等）（3）单克隆抗体的制剂技术3.单克隆抗体的应用（四）基因工程技术基因工程实际上包括了体外基因工程（DNA体外重组）和体内基因工程（DNA体内重组）两种方式。一般指体外基因工程。1.基因工程的基本程序基因工程操作程序包括取得目的基因，将目的基因同载体连接构建成DNA重组体，再将经过重组的DNA转化导入受体细胞（宿主细胞），并使目的基因和载体上其它基因地形状得以表达（即基因转录和翻译为目的蛋白）见图p57（五）生物合成技术1.利用微生物代谢产物的药物（1）醇酮类药物：如乙醇，丁醇，丙醇及甘油。（2）有机酸类药物：如醋酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸（3）维生素类药物（4）氨基酸类药物（5）生物碱类药物（6）抗生素2.半合成药物第四章固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。有机溶剂沉淀法向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。等电点沉淀法两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。结晶法改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。（一）盐析结晶法这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。（二）透析结晶（三）有机溶剂结晶（四）等电点结晶（五）温度诱导结晶第五章吸附法吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。预处理上样吸附洗杂洗脱再生常用吸附剂：1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。2)人造沸石人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素C的分离。3)磷酸钙凝胶在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。4)白陶土5)氢氧化铝凝胶用于蛋白质及酶的分离。6)氧化铝活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。7)硅胶最常用8)滑石粉惰性助滤剂9)硅藻土惰性助滤剂10)皂土11)聚酰胺粉12)大孔网格聚合物吸附树脂极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等第六章离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱第七章凝胶层析它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。VC大分子小分子ABCV0ViGPC测分子量Y=A+BX第八章亲和层析利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand），与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）亲和层析的设计原理和过程：1)配基固定化选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。2)吸附样品亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。3)样品洗脱选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质洗脱。LSLLS＋＋S＋S＋杂质SS＋LLLLL配基样品配基固定化吸附样品样品洗脱第九章离心技术沉降作用—悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉，成为沉降作用。离心技术—在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。相对离心力—通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号×g或g表示。第十章膜分离技术分离范围分离动力一般过滤>1μm压力差微孔过滤0.01~1μm压力差透析5~100Å分子扩散超级过滤5~100Å压力差反渗透<5Å压力差电渗析<5Å电能第十一章制备型高效液相色谱制备型HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质（>0.1g）HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱，然后进行检测和分部收集。泵色谱柱检测器色谱数据处理溶剂按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱，键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱，疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱等。色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。分离度Rs理论塔板数N容量因子K’—为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中得总摩尔数之比。选择因子α1、分类：

（1）根据氨基酸在pH5.5溶液中带电状况分为酸性、中性及碱性氨基酸三类。

（2）依R基团差异亦分为：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸及杂环氨基酸三类其中L-组氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸及L-羟脯氨酸为杂环氨基酸，

L-酪氨酸及L-苯丙氨酸为芳香族氨基酸，其余均为脂肪族氨基酸。2、性质：（1）物理通性：天然氨基酸纯品均为白色结晶性粉末，熔点及分解点均在200℃以上。在有机溶剂中溶解度一般较小。均为两性电解质，各有一定等电点。除甘氨酸外都有旋光性。

氨基酸能使水的介电常数增高,而一般的有机化合物乙醇、丙酮等却使水的介电常数降低。是以离子晶格组成，而一般的有机化合物是由分子晶格组成的。（2）化学通性：

α-氨基酸共同的化学反应有两性解离及林海定反应、酰化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽键结合反应及与甲醛和亚硝酸的反应等。

特殊基团反应：

酪氨酸的酚羟基可产生米伦反应与福林－达尼斯反应；

精氨酸的胍基产生坂口反应；

色氨酸的吲哚基与芳醛产生红色反应；

组氨酸的咪唑基产生Pauly反应；

苯丙氨酸硝化后于碱性条件下产生桔黄色反应；

胱氨酸及半胱氨酸经酸或碱破坏后可与醋酸铅产生铅黑反应；

半胱氨酸在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠（硝普盐）反应生成紫红色化合物。

色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光谱，色氨酸最大吸收波长为279nrn，苯丙氨酸为259nm，酪氨酸为278nm。但构成天然蛋白质的20种氨基酸在可见光区均无吸收。

氨基酸的上述理化性质是蛋白质与氨基酸合成、转化、分离纯化及定性定量检测的依据二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用

1、氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，故生物体中众多蛋白质的生物功能，无不与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密切的关系。因此氨基酸对维持机体蛋白质的动态平衡有极其重要的意义。生命活动中人及动物通过消化道吸收氨基酸。通过体内转化而维持其动态平衡，若其动态平衡失调，则机体代谢紊乱，甚至引起病变。2、许多氨基酸尚有其特定的药理效应。（－）氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系氨基酸为构成天然蛋白质的基本单位，故蛋白质营养价值实际是氨甚酸作用的反映。健康人靠膳食中的蛋白质获取各种氨基酸满足机体需求。缺乏蛋白质则影响机体生长及正常生理功能，抗病力减弱引起病变。消化道功能严重障碍者及手术后病人常因禁食无法获得足够蛋白质，自身蛋白质过量消耗，致使营养不良而导致病情恶化或预后不良。

临床上常通过直接输入氨基酸制剂改善患者营养状况，增加治疗机会，促进康复。

赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等8种氨基酸必需氨基酸：人及哺乳动物自身不能合成，需由食物供应。半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分别由其他氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)产生，若食物中提供了足够的该氨基酸（氨酸及酪氨酸），可减少对其他氨基酸（蛋氨酸及苯丙氨酸）的需求量。

氨基酸（精氨酸及组氨酸）合成速度较低，通常难以满足需求，需由外界补充一部分。（二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物（三）治疗肝病的氨基酸及其衍生物（四）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物（五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物（六）其它氨基酸类药物的临床应用第二节氨基酸类药物的生产方法

1、目前全世界天然氨基酸的年总产量在百万吨左右，其中产量较大者有谷氨酸、蛋氨酸及赖氨酸，其次为天门冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它们主要用于医药、食品、饲料及化工行业中。

2、目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成法等四种。

3、氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐等化学方法或酶转化法生产。一、水解法（一）基本原理与过程以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。水解法生产氨基酸的主要过程为水解、分离和结晶精制三个步骤。

1、蛋白质水解方法目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水解法三种。（1）酸水解法蛋白质原料用6～10mol／L盐酸或8mol／L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24h，除酸后即得多种氨基酸混合物。此法优点是水解迅速而彻底，产物全部为L-型氨基酸，无消旋作用。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏，且产生大量废酸污染环境。（2）碱水解法蛋白质原料经6mol／L氢氧化钠或4mol／L氢氧化钡于100℃水解6h即得多种氨基酸混合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用。工业上多不采用。（3）酶水解法蛋白质原料在一定pH和温度条件下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。此法优点为反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，无消旋作用。缺点是水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。2、氨基酸分离方法

氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。

（1）溶解度法是依据不同氨基酸在水中或其它溶剂中的溶解度差异而进行分离的方法。胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，故可将混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分开。

（2）特殊试剂沉淀法系采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。

如邻二甲苯-4-磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸；

组氨酸可与HgC12形成不溶性汞盐沉淀，后者经处理后又可获得游离组氨酸；

精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。

（3）吸附法是利用吸附剂对不同氨基酸吸附力的差异进行分离的方法。如颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来。

（4）离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，故同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同。3、氨基酸的精制方法

分离出的特定氨基酸中常含有少量其它杂质，需进行精制，常用的有结晶和重结晶技术，也可采用溶解度法或结晶与溶解度法相结合的技术。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0，故丙氨酸可在pH6.0时，用50％冷乙醇结晶或重结晶加以精制。

溶解度与结晶技术相结合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若将含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍体积（w／v