医院科研系统讲座WB总蛋白内参定量

免疫印迹总蛋白内参定量与免染技术

Presenter2WesternBlot定量归一化CBA目标蛋白CBA内参100100200光密度读值归一化因子1:1:210050200光密度读值看上去10050100实际上3常用看家蛋白作为内参不一定可靠4看家蛋白的线性较差CoomassietotalproteinmeasurementGAPDHJProteomeRes.2011Mar4;10(3):1416-9.5DittmerAandDittmerJBeta-actinisnotareliableloadingcontrolinwesternblotanalysisElectrophoresis(2006).27,2844–2845.稀释抗体浓度、减少孵育时间和曝光时间都无助于actin信号的最终过曝。SuzukiO,KouraM,NoguchiY,Uchio-YamadaK,MatsudaJUseofsamplemixturesforstandardcurvecreationinquantitativewesternblots.JExpAnim(2011).60,193–196.Tubulin信号在不同上样量情况下都保持了类似的强度。

看家蛋白线性较差6看家蛋白在某些情况下表达不恒定Rocha-MartinsM,NjaineB,SilveiraMSAvoidpitfallsofinternalcontrols:validationofreferencegenesforanalysisbyqRT-PCRandwesternblotthroughoutratretinaldevelopment.PLoSOne(2012).7,e43028.大鼠视网膜发育的不同阶段，Tubulin和actin的表达量变化很大。GreerS,HoneywellR,GeletuM,ArulanandamR,RaptisLHousekeepinggenes:expressionlevelsmaychangewithdensityofculturedcells.JImmunolMethods(2010).355,76–79.NIH3T3成纤维细胞培养过程中Tubulin和GAPDH随细胞浓度变化差异很大。7AldridgeGM,PodrebaracDM,GreenoughWT,WeilerIJTheuseoftotalproteinstainsasloadingcontrols:analternativetohigh-abundancesingle-proteincontrolsinsemi-quantitativeimmunoblotting.JNeurosciMethods(2008).172,250–254.VigelsøA,DybboeR,HansenCN,DelaF,HelgeJW,GuadalupeGrauA.GAPDHandβ-actinproteindecreaseswithaging,making

StainFreetechnologyasuperiorloadingcontrolinWesternblottingofhumanskeletalmuscle.JApplPhysiol(2015)118(3):386-94.总蛋白的线性及表达恒定性更佳8WhenthecomparingcellsreceiveddifferentchemicalordrugtreatmentthatmaycausechangesonHKPs--kinaseinhibitortreatmentNeurobiologyofDisease54(2013)280–288Whencellbehaviorandmorphologymaychangedramaticallyinatimecoursestudy–cellcyclestudyJ.Biol.Chem.

2011

286:

37483-37495.Whensubjectingsamplestogeneticmodifications–transformation,transfection,transgenicmodels,KnockoutsTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVOL.287,NO.6,pp.3733–3750,February3,2012THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVOL.286,NO.35,pp.30662–30669,September2,2011从2010年起，JBC超过200篇文章使用了总蛋白代替看家蛋白作为WB内参！总蛋白作为WB内参的文献越来越多9被审稿人要求使用总蛋白作为内参10审稿人对WB数据的要求越来越高JCLININVEST（IF=13）编委Ushma评审western数据时的关键问题V3免染WesternBlot流程11蛋白分离

15分钟TGX胶电泳凝胶蛋白可视化

1分钟紫外激活成像蛋白转印

7分钟TBT转印确认转印

1分钟印迹膜成像

gelandblot蛋白定量

总蛋白内参归一化Stain-freeimageofpre-transfergelStain-freeimageofpost-transfergelStain-freeimageoftheblotChemiimageoftargetproteinTotalproteinnormalization12V3免染WesternBlot流程动画演示13ABCD

-tubulinGAPDH

-actin5040302010Stainfreeblotimage504030201050403020105040302010免染总蛋白的线性比看家蛋白更优异Action、Tublin、GAPDH表达丰度高化学发光检测灵敏度高化学发光为非线性反应14总蛋白做定量归一化的定量结果更可靠15总蛋白做定量归一化的定量结果更可靠两种不同培养条件下HCT116中c-myc的表达量变化（瞬转某个基因之后）以actin为内参，c-myc的表达量变化在两种培养条件下变化趋势不一致16总蛋白做定量归一化的定量结果更可靠以TPN来定量，c-myc在两种培养条件下的变化趋势一致TPN定量得出了与HKP定量不同的结论，但是与其他实验结果一致，并符合实验者预期17台湾大学医学院肝移植病例肝移植后Beta-Actin表达不恒定Stain-Free更能准确显示每个泳道的真实上样量总蛋白比Actin能更准确反映泳道上样量18总蛋白比Actin作为内参定量更准确数据：四川大学华西再生实验室19以Actin为内参对VEGF表达定量的结果有2点疑问：三个Control样品中的VEGF表达量差异很大梗死1的VEGF表达应较Control有较大上调，但是Actin的内参定量并未显示该趋势

以免染总蛋白为内参对VEGF表达进行定量的结果基本符合样品的实际情况（Control组表达量近似），并符合实验预期（梗死1的VEGF表达量会上调）。总蛋白比Actin作为内参定量更准确20“IenjoyedusingtheV3WesternWorkflow.Itiseasyandfast.Thestain-freeisfantastic!Itisconvenientandrequireslittleextrawork.Iwillcontinuetousestain-freeapproachesasanalternativetohousekeepingproteins.”我非常喜欢V3的操作流程，它简单快速。免染胶非常了不起。我将继续用免染的方法来代替看家蛋白定量。

Fur-ChiChen,TennesseeStateUniversity,US用户声音21

“WehavebeenroutinelyusingtheStainFreegelsandChemiDocMPforimaginggelsaswellasnormalizingwesternblots.

WeprimarilyusedSyproOrangeinthepast,butthestainfreegelshaveessentiallyreplacedthatneed,aswellassavinganhourofpost-staining.”“我们已经将免染胶和ChemiDocMP作为westernblot定量的常规方法。我们之前曾采用SyproOrange，但是现在免染技术已经完全取代了SyproOrange。” RyanB.JensenPh.D. AssistantProfessorofTherapeuticRadiology用户声音22Ryan发表的文献中使用免染总蛋白做内参

23耶鲁医学院Ryan的采访视频Over90stain-freeTPNpapersbyMay15,201525Mol.Cell.Biol.2014,34(1):96PLoSONE2013,8(12):e81784文献中的免染总蛋白内参数据26DevelopmentalBiologyVolume376,Issue2,15April2013,Pages171–186文献中的免染总蛋白内参数据27MolecularandCellularBiologyDecember2014,Volume34,Issue24文献中的免染总蛋白内参数据28MolCellProteomics2014Nov20;13(11):2975-85.Epub2014Jul20.文献中的免染总蛋白内参数据29SumoylationofRap1mediatestherecruitmentofTFIIDtopromotetranscriptionofribosomal