鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠具有免疫调节能力

鳞柄小奥德蘑（Oudemansiellafurfuracea），又称为长根小奥德蘑鳞柄变种(O.radicatavar.furfuracea)，或者是鳞腿长根金钱菌(Collybiaradicatavar.furfuracea)[1]，现为蘑菇目（Agaricales）膨瑚菌科（physalacriaceae）狭义小奥德蘑属（Oudemansiella）一独立品种。这种蘑菇的味道极其鲜美，营养价值丰富，是人类餐桌上的首选。而且它有“草鸡枞”和“露水鸡枞”的称号，因为鳞柄小奥德蘑属于腐生生菌，易于人工栽培，重要的是其经济价值较高[2]，所以越来越多的人不断的尝试种植，目前在河北、北京和山东均有人工种植。目前国内对于该菌的研究主要集中在育种和栽培等方面[3]，但是有关鳞柄小奥德蘑粗多糖的生物活性方面还未见报道。多糖是一种天然高分子化合物，由单糖聚合而成，在动植物、微生物中分布极广[4]，也很重要，有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉，还有我们今天要说的蘑菇多糖，它是一种水溶性蛋白多糖，具有特殊的生物活性[4]。多糖的功能多种多样，如免疫调节、抗氧化、抗肿瘤，抗凝血以及降三高的作用[5-6]，因此有“生物反应调节剂”这一美称[6]。多糖生物学一直都是现代医学，现代生物学的研究热点，随着这些领域的发展，多糖对人体的巨大优势被呈现出来，尤其是多糖生物活性与免疫系统的联系渐渐的被人类所了解，比如在癌症的免疫调节方面就发挥着巨大的作用，好多抗肿瘤的药物当中就有免疫治疗物的成分。近年来许多科学家也对一些种类的多糖进行了有关免疫调节的实验，可见科学家极大重视免疫调节剂的研究[4]。如宫丽华等利用柘木根多糖研究对小鼠腹腔巨噬细胞的激活及抑瘤作用[7]；张莘莘等利用黑灵芝多糖研究对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响[8]；王晶等利用阿魏侧耳胞外多糖研究对小鼠巨噬细胞的激活作用[9]等。但是目前，尚未有鳞柄小奥德蘑多糖相关研究报道[3]。巨噬细胞是一种免疫细胞，具有许多功能。它们是研究细胞吞噬作用，细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞不但容易存活而且容易获得，易于培养，并且可以纯化。它也属于非增殖性细胞群，可在适当条件下存活2-3周。因为它们主要用作原代培养，所以很难长期存活。它们也是一群来自单核细胞组织中的白细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞都属于吞噬细胞，参与脊椎动物的非特异性防御（先天免疫）和特异性防御（细胞免疫）[7]。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式进行细胞碎片和病原体的吞噬（即吞噬和消化），并激活淋巴细胞或其他免疫细胞对病原体作出反应。总而言之它们大多数分布在各大组织中，经常在炎症反应以及免疫调节中发挥着其独特的作用[10]。被誉为我们人体的消防战士。正常情况下巨噬细胞大多处于相对静止状态，一旦受到其它因素的激活就可产生许多不同的细胞因子，引起一系列的免疫应答[11]，对多种疾病的临床治疗有巨大作用。NO、TNF-α、IL-1、IL-6是巨噬细胞分泌的主要细胞因子，NO被认为是“巨噬细胞活化的标志物之一”[12]，也是巨噬细胞受到活化后分泌的一类具有免疫调节作用的细胞因子。可是在以前NO被认为是极其不稳定的物质，在空气中很快转变成二氧化氮产生刺激作用。氮氧化物主要损害呼吸道，使人出现胸闷，呼吸窘迫。NO浓度过高还可导致高铁血红蛋白血症，NO是近年来发现的一种气体信使分子，它可以通过弥散的方式激活鸟苷酸环化酶，生成环磷酸鸟苷，而发挥各种生物学效应，尤其是最近NO与巨噬细胞之间的关系被人们所熟知并逐渐运用到科研和医疗中。TNF-α被称为肿瘤坏死因子，它可以促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生。它主要是与靶细胞表面的受体结合降低其溶酶体膜的通透性引起靶细胞溶解[13]，并且影响靶细胞糖代谢反应，促进其死亡[10]。TNF-α不仅自身可以参与到免疫反应中，一些其他的细胞因子的释放也会受到TNF-α的影响，共同对组织造成损伤[8]。IL-1.和IL-6都属于白细胞介素的一种。白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是在白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现在仍一直沿用。最初是指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子。现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子，两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。它还是一种专门针对白细胞病态的一种药物，可以很好控制白细胞的数量，一定量的白细胞介素还可以显著增强人体免疫力。IL-1一般是由巨噬细胞产生，能够增强细胞杀伤力，增强抗感染力，在介导炎症反应中尤为重要。而IL-6大多则为多细胞产生，能够使B细胞产生抗体，参与机体的免疫调节，代谢调节[14]。它们都是人体不可缺少的细胞因子。本论文通过原代培养法建立小鼠腹腔巨噬细胞体外培养体系，采用荧光探针标记和双抗体夹心法检测细胞内NO含量和TNF-α、IL-1和IL-6的分泌量，研究鳞柄小奥德蘑粗多糖对巨噬细胞免疫调节作用的影响。2.1.3液体配制。F12K：选粉剂一瓶，准确称量2.50gNa2CO3，0.1g链霉素，0.06g青霉素，然后一块倒入洁净的锥形瓶中，加入950ml超纯水充分搅拌溶解，用pH试纸调pH至7.2，再倒入1L的容量瓶进行定容，在超净工作台里过滤以除去一些杂质和肉眼看不到的细菌，最后进行分装，放在-20℃的环境中保存备用。D-Hanks平衡盐溶液：准确称量8gNacl，0.12gNa3PO4，0.4gKCl，0.06gKH2PO4，0.35gNaHCO3于洁净的锥形瓶中，加入超纯水约950ml充分搅拌溶解，调pH至7.2，再倒入1L的容量瓶进行定容，在超净工作台里过滤以除去一些杂质和肉眼看不到的细菌，最后进行分装，放在-20℃的环境中保存备用。2.2实验方法2.2.1多糖的提取将鳞柄小奥德蘑子实体用流水冲洗表面除去泥沙，置于60℃恒温干燥箱中烘干，粉碎机粉碎，200目筛绢过滤后乙醇除脂[15]，低温烘干。按照1:40的料液比；1h的提取时间，90℃的提取温度，3次的提取次数为提取条件，热水浸提[16-17]，离心（4000r/min4℃20min）取上清。将上清浓缩4倍用浓度为75%的乙醇沉淀，4℃过夜，离心收集沉淀，用95%乙醇、无水乙醇、丙酮醇沉，Sevage（氯仿：正丁醇=4:1）试剂除蛋白，直至中间层无白色沉淀；自来水流水透析24h，蒸馏水透析12后真空冷冻干燥得鳞柄小奥德蘑子实体粗多糖。2.2.2巨噬细胞的收集和培养（1）小鼠脱颈处死，立即放入75%的酒精中浸泡1min，重复2次转入超净工作台，取5ml的F12K轻轻的注射进小鼠腹腔，轻柔腹部，在无菌的环境下打开腹腔，从内取出细胞悬液放到离心管里，1500r/min离心10min，弃上清，用含15%血清的完全培养基悬浮细胞。（2）血细胞计数板统计细胞数量，调节细胞密度为6×106个/ml，接种至24孔细胞培养板，每孔1ml，放置在37℃，5%CO2的恒温培养箱内培养。2.2.3多糖处理待细胞贴壁后，加入鳞柄小奥德蘑粗多糖处理，设空白对照组、阳性对照组和实验组。空白对照组添加等量的完全培养液，阳性对照组添加终浓度为20mg/L的脂多糖（LPS），实验组分别添加终浓度为25、50、100和200mg/L的抽滤后鳞柄小奥德蘑粗多糖溶液。每组设3个重复。多糖处理24h后，收集细胞上清液-20°C冷藏备用。2.2.4细胞内NO含量的检测——荧光探针法（1）在24孔细胞培养板置入无菌的细胞爬片，按2.2.2方法收集细胞并接种，待细胞贴壁后，添加脂多糖和不同浓度鳞柄小奥德蘑多糖处理。（2）多糖处理48h后，取出细胞爬片，细胞面朝上。参照DAF-FMDA荧光探针说明说明书，加入探针（探针：稀释液=1:400），37℃，5%CO2培养箱孵育30min。（3）细胞用D-Hanks洗涤2-3次，将未进入细胞内的DAF-FMDA去除。（4）快速的在荧光显微镜下观察并且拍照，整个过程要避光处理。2.2.5TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的测定——双抗体夹心法按试剂盒要求操作。2.2.6统计分析采用SPSS20.0软件进行统计分析，实验结果以平均数±标准误（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）是为了组间差异性比较。P<0.01，表示差异极显著；P<0.05，表示差异显著。光学显微镜观察显示，体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞（见图1）呈不规则性，贴壁生长，细胞透光性较好3.2巨噬细胞NO分泌的检测荧光显微镜观察结果显示，与空白对照相比，添加终浓度为25~200mg/L多糖处理后，巨噬细胞内探针的荧光亮度显著增强（见图2）。说明48h多糖处理后的巨噬细胞可使NO的分泌量显著增加A，空白对照组；B~E，25、50、100、200mg/L鳞柄小奥德蘑多糖处理组；F，20mg/LLPS处理组。A,control;B~E,thetreatmentgroupof25、50、100、200mg/LOudemansiellafurfuraceaＦ,thetreatmentgroupof20mg/LLPS.3.3巨噬细胞TNF-α、IL-1和IL-6分泌量的测定酶联免疫吸附实验结果（见表）显示，与空白对照相比，25~200mg/L的鳞柄小奥德蘑粗多糖可极显著提高巨噬细胞对IL-6的分泌量，100~200mg/L的鳞柄小奥德蘑粗多糖可显著提高巨噬细胞对TNF-α、IL-1的分泌量。表1鳞柄小奥德蘑多糖对小鼠巨噬细胞TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的影响Table1EffectsofpolysaccharidesfromOudemansiellafurfuraceaonTNF-α、IL-1、IL-6ofmurinemacrophages与空白对照组相比，显著差异（P<0.05）用“*”表示，极显著差异（P<0.01）用“**”表示4.1NO分泌量的检测NO是细胞内信号分子，参与机体的免疫调节。巨噬细胞活化后，胞内的NO合成酶基因被激活从而生成NO[12]。F-FMDA，它可以穿过细胞膜进入胞内与酯酶作用形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身只有微弱的荧光，但是与NO反应后就能出现非常强烈的荧光现象，根据荧光亮度可以判断细胞内NO的多少[20]。与空白对照相比，25~200mg/L鳞柄小奥德蘑粗多糖和20mg/LLPS处理组细胞内绿色荧光的强度和平均光密度明显增强。说明，25~200mg/L鳞柄小奥德蘑粗多糖可以促进巨噬细胞产生NO，且具有浓度依赖性。4.2TNF-α、IL-1、IL-6分泌量的测定TNF-α是巨噬细胞分泌的一种多效细胞因子，在体外和体内对肿瘤细胞均有显著作用，不仅如此，它还具有多种免疫调节作用[7]。IL-1是巨噬细胞产生的一类细胞因子，其生物学作用十分广泛，主要包括调节机体免疫和介导炎症反应的作用[18]。IL-6是多细胞分泌的一类细胞因子，不仅能促进Ｂ细胞前体产生抗体，而且能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其免疫功能[19]。由表１可知，随着鳞柄小奥德蘑多糖添加量的提高，TNF-α、IL-1、IL-6分泌量均显著上升。其中，100~200mg/L鳞柄小奥德蘑多糖可显著增加小鼠巨噬细胞TNF-