免疫组织化学及面波勘探原理及其应用

PAGE免疫组织化学的基本知识1免疫组织化学的概念：

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂

(荧光素、酶、金属离子、同位素)

显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

2免疫组化实验所用的抗体有哪些？

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

3免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，细胞标本包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

4石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01

mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

5免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

6抗体交叉反应的原因：

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：

1.

抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。

2.

共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。

3.

决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。

免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述

*免疫细胞化学(immunocytochemistry,

ICC)

-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂

(荧光素、酶、金属离子、同位素)

显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。

(一)

对抗原和抗体的要求

*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。

-对抗体的要求：纯度高、比活性强；

*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。

-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

(二)

抗原

(antigen,

Ag)

*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：

-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；

-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

*根据抗原是否显示免疫原性分为：

-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。

*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载

体

*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole

limpet

hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine

serum

albumin,

BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

（三）抗体

(antibody,

Ab)

1、抗体的概念：

*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内；

-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、

IgD、IgE、

IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。

*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

-特异性强、抗体产量高。

*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-特异性低，会产生抗体的交叉反应。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。

-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备

*动物的选择

*佐剂(adjuvant)

*免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价的测定

*放血或定期抽血

免疫组化常见问题及解决方法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色

①

确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②

确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③

对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④

检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤

检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥

检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦

检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧

检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨

检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

①

标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

②

不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③

抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

④

切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

⑤

孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。

如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

非特异性染色

①

是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：

灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。

②

是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。

③

所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

④

一抗的使用浓度是否过高。

⑤

清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l

Tris—HCl，0.15mol/l

NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。

⑥

DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。

⑦

标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。

⑧

检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

抗体的保存

抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。

绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。

被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。

保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。石蜡切片免疫组化染色步骤载玻片的处理：

抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001

APES、ZLI-9003

HistogripTM或ZLI-9005

Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：

1.1

APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

1.2

HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。

1.3

Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。

2、常用酶消化：

2.1

胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

2.2

胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen

IV（IV型胶原）等。

2.3

g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10

3、抗原热修复：

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064

±枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0

0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

3.1

石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

3.2

石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

3.3

石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

4、免疫组化染色步骤：

（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）

1）石蜡切片脱蜡至水。

2)3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

3)

蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

4)

5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5)PBS冲洗，5分钟×3次。

6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

7)PBS冲洗，5分钟×3次。

8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

9)

PBS冲洗，5分钟×3次。

10)

显色剂显色（DAB或AEC）。

11)自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2免疫组化实验过程中的要点和技巧1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。

有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

Bouin

S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4．烤片：60℃

30分钟或37℃

过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

6．脱片问题：

Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES

1：50

丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰

Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14．在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。免疫组织化学方法及常见问题解答按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。免疫组化ABC法步骤1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；3、加入配好的0.3%TritonX100（30%TritonX100+0.01MKPBS100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。免疫组化SP法步骤：SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。一般的sp法步骤啊，具体如下：1、烤片，68℃，20分钟，2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min⇒二甲苯II20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3×5min；8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。免疫组化方法中关键环节及其原理解述一、酶免疫组化的关键环节1、标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。9、抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。12、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。二、免疫荧光方法中的重要环节1、冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）9、拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。3、在什么情况下使用Triton-X100（1）TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。（2）其作用原理：TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。（3）TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。4、封闭血清的选择原则是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。5、抗体孵育条件的比较？（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。7、DAB显色时间如何把握？（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。8、免疫组化结果如何分析？（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。13、苏木素复染时间的把握？（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。（5）常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。15、脱片产生的原因和如何防止脱片？（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。（4）没烤好，时间短温度不够之类。（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（6）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。16、背景染色较深的原因有哪些？（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4？C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长？答：返蓝可以用碱性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10min。淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。毕业设计（论文）题目：面波在地震波场中的特性研究及其应用Surfacewaveinthecharacteristicsofseismicwavefieldresearchanditsapplication学生姓名：专业：勘查技术与工程班级：指导教师：二零年六月Ⅰ摘要瑞利面波勘探是近年发展起来的一种新的浅层地球物理勘探方法，具有简便、快速、经济、分辨率高、成果直观、适用场地小等优点，已在许多领域得到应用，并取得了良好的应用效果[1]。瑞利面波是一类频率较低、能量较强的次生波，且主要沿着介质的分界面传播，其能量随着与界面距离的增加迅速衰减。瑞利面波与反射波、折射波一样都含有地下介质的地质信息。本文从瑞利面波的概念、工作原理及方法、频散特征、反演研究以及实际资料的应用等方面，用多道检波器测量来了解面波勘探在浅层地表调查中的应用。关键词:瑞利面波、频散曲线、波动方程、瞬态瑞雷波勘探。东华理工大学毕业设计（论文）ABSTRACTⅡABSTRACTRayleighwaveexplorationisdevelopedinrecentyears,anewshallowgeophysicalexplorationmethods,itisasimple,quick,economy,highresolution,achievementsintuitive,applicablesite,hastheadvantagesofsmallfindapplicationinmanyfields,andhaveachievedgoodapplicationeffect.Rayleigh'sisakindoflowerfrequency,energystrongsecondarywave,andmainlytheboundarysurfacealongthemedium,theenergywiththespreadofinterfacedistanceattenuationincreasesrapidly.Rayleighwavereflectionwave,withallcontainthesamerefractionwaveofundergroundmediumgeologicalinformation.ThisarticlefromRayleigh'sconcept,principleandmethod,frequencydispersioncharacteristics,andinversionstudyandtheactualmaterialapplicationetc,withmulti-channeldetectorsmeasurementstounderstandsurfacewaveexplorationintheapplicationofshallowsurfacesurvey.keywords:Rayleighwave，frequencydispersecurve,waveequation,transientstateRayleighwaveprospecting.东华理工大学毕业设计（论文）目录目录绪论 11.工区自然地理和地质、地球物理特征 31.1工区自然地理 31.2工区地质概况 42.工作方法与技术 42.1面波勘探的基本原理及特点 52.2野外工作方法 72.3工区布置 72.3.1主要的仪器设备及其设置的参数 82.3.2仪器要求 92.3.3采集系统的布置 92.3.4使用规范 92.4野外数据采集 103.数据处理 113.1处理方法和原理 113.2数据处理内容 113.3处理软件要求 113.4处理过程的要求 123.5面波数据处理流程 124.资料解释 155.结论与建议 175.1结论 175.2建议 17致谢 18参考文献 19东华理工大学毕业设计（论文）绪论PAGE16绪论瑞利面波(以下简称面波)在反射波地震勘探中作为一种干扰波，被压制和去除。实际上面波在地层介质中传播，肯定携带所经过介质的丰富的地质信息(如岩性、速度、深度等)，将这些反映地层特殊属性的有用信息提取出来，可解决地质问题，尤其是浅层地质问题。近几年来的研究和实际应用表明，瞬态瑞利波勘探(以下简称瑞利波勘探)法对浅表薄层勘探具有分辨率高、施工条件要求低、仪器轻便，探测速度快，经济效益好等优点，受到工程及环境勘探领域人员的极大关注，并在浅表层工程勘探中得到了发展，方法和技术渐趋成熟。然而在地形起伏的山地及西北沙漠地区，它的应用还很少，地质结构调查工作的开展也近乎空白。这些地区的地面地形突起陡降，第四系覆盖层地层结构复杂，采用常规的地震勘探方法(如反射波法、折射波法、微地震测井法等)对其进行地质结构调查工作，往往难度大、投入成本高，而得到的资科的品质低，勘探效益差。面波勘探在这些地区的应用就有了实际的意义，并且能够得到很好的效果。1985年，斯托克(Stokoe)和纳扎利安((Nazarian)采用了冲击震源，通过两个检波器之间波的互谱相位信息，求出了不同频率面波的相速度，进而求出道路断面的瑞利波速度分布，这是最初的瞬态瑞利波勘探试验，从而也引起了瞬态瑞利波勘探方法的真正兴起。由于稳态瑞利波所用的设备笨重，激发能量、频率范围有限，我国于1990年左右又开始了对瞬态瑞利波勘探技术的研究试验。最初的数据采集一直利用两个竖直分量检波器接收方式，数据的信噪比较低，数据处理也不完善，探测深度和精度都有限。1993年，刘云祯等利用自己设计的地震仪，在数据采集上采用展开排列多道接收，在数据处理上则通过多道面波记录和专用处理软件来处理面波速度变化曲线，再经反演拟合计算进行速度分层解释，把锤击震源的面波探测深度由10米左右提高到约30米，条件好的情况可达50米以上，基本能满足岩土工程勘察的需要，从而使瞬态瑞利波勘探技术上了一个新台阶，实现了瞬态瑞利波勘探实用化、商品化。1995年，北京市水电物探研究所自行研制出SWS瞬态瑞利波勘探系统，经过与日本稳态面波仪对比可知，使用24磅大锤做振源的SWS系统，在软弱地层勘察方面优于使用350kg激振器的日本稳态面波系统。纵观整个瑞利波的发展历史，对瑞利波勘探法的研究总体上是一个从天然场源法到人工场源法，从稳态法到瞬态法，从理论研究逐步走向了试验和实践阶段的发展过程。瑞利面波是一类频率较低、能量较强的次生波，且主要沿着介质的分界面传播，其能量随着与界面距离的增加迅速衰减，英国数学物理学家Rayleigh于1887年从理论上对该类型的波给予了证明。瑞利面波与反射波、折射波一样都含有地下介质的地质信息。瑞利波勘探是一种新兴的岩土原位测试的浅层勘探方法。瑞利面波在振动波组中能量最强，振幅最大，频率最低，容易识别也易于测量。它同其它物探方法一样，可分为人工源和天然源两大类。人工源瑞利波勘探方法有两种，即瞬态瑞利波勘探和稳态瑞利波勘探。瞬态法与稳态法的区别在于震源的不同，前者是在地面上产生一瞬时冲击力，产生一定频率范围的瑞利波，不同频率的瑞利波叠加在一起，以脉冲的形式向前传播;后者则产生单一频率的瑞利波，可以测得单一频率波的传播速度。应用瞬态面波法进行现场测试时一般采用多道检波器接收，以利于面波的对比和分析。当锤子或落重在地表产生一瞬态激振力时，就可以产生一个宽频带的R波，这些不同频率的R波相互迭加，以脉冲信号的形式向外传播。当多道低频检波器接收到脉冲形振动信号后，经数据采集，频谱分析后，把各个频率的R波分离出来，并求得相应的VR值，进而绘制面波频散曲线。由多道检波数据反演处理后可得一条频散曲线，一般把它作为接收段中点的解释结果。实际上该曲线所反映的地层特性为接收段内地层性质的平均结果，故当探测场地地下介质水平方向变化较大时，只要能满足勘探深度的要求，尽量使反演所用的接收段减小，以使解释结果更具客观实际[2]。瞬态瑞雷波法是通过锤击、落重乃至炸药震源,产生一定频率范围的瑞雷波,再通过振幅谱分析和相位谱分析,把记录中不同频率的瑞雷波分离出来,从而得到一条Vr-f曲线或Vr-Kr曲线,即频散曲线。面波勘探中主要利用的是瑞雷波,其特性如下。(1)瑞雷波在层状介质中传播的频散特性在层状介质条件下,瑞雷波在介质中的传播速度是频率的函数,即瑞雷波速度随激发频率的变化而变化。该特性是瑞雷波勘探的理论基础,由于瑞雷波法不仅利用了波的运动学特征,更重要的是利用了波的动力学特征,而常规地震折射波法和反射波法主要利用波的运动学特征,且要求各层的波速或波阻抗有较大差异,因此瑞雷波对介质反映更细微。(2)瑞雷波的穿透深度与波长的关系瑞雷波水平振幅和垂直振幅从弹性介质的表面向内部呈指数衰减,主要能量集中在一个波长范围内。因此,可以认为瑞雷波的穿透深度为1个波长。(3)瑞雷波比体波衰减慢的多,离开震源一段距离,面波的能量将强于体波。这为我们在数据处理中提取面波的有用信息提供了方便。(4)瑞雷波速度与横波速度的相关性，瑞雷波速度Vr与横波速度Vs近似相等,它们之间有一定的差异,差异的大小与地层的泊松比L有关,泊松比L越大,差异越小。(5)面波勘探与地层速度的关系，折射波法要求下伏层速度大于上覆层速度,反射波要求各层介质间存在波阻抗差异,而面波勘探不受上述物性条件制约,仅要求各层介质间存在横波速度差异,由于横波速度主要与介质密度或介质的松散与密实程度有关,因此在地层划分方面有较好的分辨能力,较适合于软岩及密实度差异较大的第四系地层地区的勘探。本文通过对温泉实习基地的余山水库大坝进行面波测量，调查该地区的地表地层情况，找出F5和F6构造，从而熟悉面波勘探在浅层地表调查中的应用。东华理工大学毕业设计（论文）工作方法与技术1.工区自然地理和地质、地球物理特征工区自然地理抚州市温泉乡境内的桐山庙--青莲山一带，惯称温泉实习基地。温泉乡因境内温泉（日泉、月泉）而享有盛名。温泉实习基地位于东经116度11分6秒至116度13分12秒，北纬27度59分12秒至28度0分40秒，距东华理工学院抚州校区大约四十公里。抚州高坪公路和临川丰城公路穿过该区东南部，有公共汽车经过实习区。本区距向（塘）乐安铁路上顿渡车站5公里，交通便利。温泉实习基地交通位置如图1-1,中国移动和联通网信号覆盖该区，并有公用电话提供服务。图1-1温泉实习基地交通位置图该区地处南方典型丘陵地区，地形属三类地形。实习区属温湿气候区，年平均气温180C，降水较丰富，年平均降水量为1789.6毫米，季节变化不十分明显，3-7月份为雨季，9-10月份少雨，年蒸发量为1610毫米，潮湿系数为1.11。区内有三条小溪，自西向东为塘家岭溪、青莲溪及余山溪。一般流量为0.05-1.5立方米/秒。因其上游的流域面积多为前震旦系的变质岩，富水程度较差，且在设计区内构造复杂。干旱年月有时断流。正因如此，在设计区内修造三座小型水库。拦截这三条溪水，供灌溉之用。该区农作物以水稻为主，同时也有其他经济作物，如甘蔗、棉花、大豆、红薯和莲子等。没有工业和其它产业。该地区经济条件相对比较落后，人民生活水平普遍较低。1.2区域地质概况1.2.1地质构造本区出露的主要地层有前震旦系板溪群下亚组（Ptnn2），石炭系下统的华山苓组和梓山组（C1z）及其因风化形成的残、坡积物以及第四系。区内断裂发育，有NE向断层两条(F5、F6)。见图1-2。图1-2温泉区地质图图1-2区域地层地质图2.工作方法与技术2.1面波勘探的基本原理及特点面波是一种特殊的地震波，它与地震勘探中常用的纵波（P波）和横波（S波）不同，它是一种地滚波。弹性波理论分析表明，在层状介质中，拉夫波是由SH波与P波干涉而形成，而瑞利波是由SV波与P波干涉而形成，且R波的能量主要集中在介质自由表面附近，其能量的衰减与r-1/2成正比，因此比体波（P、S波∝r-1）的衰减要慢得多。在传播过程中，介质的质点运动轨迹呈现一椭圆极化，长轴垂直于地面，旋转方向为逆时针方向，传播时以波前面约为一个高度为λR（R波长）的圆柱体向外扩散。在各向均匀半无限空间弹性介质表面上，当一个圆形基础上下运动时，由它产生的弹性波入射能量的分配率已由Miller（1955年）计算出来，即P波占7%、S波占26%、R波占67%，亦就是说，R波的能量占全部激振能量的2/3，因此利用R波作为勘探方法，其信噪比会大大提高。（见图2-1）图2-1能量分配图面波勘察成果具有地层高分辨的特点，同时获得地层物性的参数。瑞利面波方法用于岩土勘察，与以往的弹性波勘察方法差别在于，它应用的不是纵波和横波，而是以前视为干扰的面波。其原理是，面波具有频散的特性，其传播的相速度随频率的改变而改变。这种频散特性可以反映地下岩土介质的特性[4]。瑞利面波的特点：（1）在地震波形记录中振幅和波组周期最大，频率最小，能量最强；（2）在不均匀介质中R波相速度（VR）具有频散特性，此点是面波勘探的理论基础；（3）由P波初至到R波初至之间的1/3处为S波组初至，且VR与VS具有很好的相关性，其相关式为：VR=VS•（0.87+1.12μ）/（1+μ）；式中：μ为泊松比；此关系奠定了R波在测定岩土体物理力学参数中的应用；（4）R波在多道接受中具有很好的直线性，即一致的波震同相轴；（5）质点运动轨迹为逆转椭圆，且在垂直平面内运动；（6）R波是沿地表传播的，且其能量主要集中在距地表一个波长（λR）尺度范围内。依据上述特性，通过测定不同频率的面波速度VR，即可了解地下地质构造的有关性质并计算相应地层的动力学特征参数，达到岩土工程勘察之目的[3]。瑞利面波技术成果，在地层分辨率方面的突出表现，激发进一步研究的动力。同时其成果的缺陷引发研究人员对客观事物复杂性的认识。对瑞利面波的研究，由稳态到瞬态，采用两点接收，从未见到瑞利面波在地层介质中传播在地面所接收到的面貌，即应用中瑞利面波在时间-空间域中的形态特点。研究处于一种理性化状态。二十世纪90年代中期，北京市水电物探研究所刘云祯提出多道瞬态面波勘察与检测系统，使瑞利面波技术的研究开创新局面，使该技术应用于岩土勘察与检测走出一条新路。刘云祯提出的多道瞬态面波方法，在震源方面：提出采用不同材质和轻重的锤子，采用落重法和炸药激振的方法；在接收方面：提出采用地震勘探中采用的多道排列的方法，例如：12道、24道或更多道组成的排列。由此，瑞利面波在瞬态激振条件下的传播特征进入可视状态，为研究瑞利面波的传播特征、面波频散的提取计算方法研究、认识瑞利面波在传播过程中具有多组份波传播特征、以及应用瑞利面波中的干扰等问题开创了新局面，为瞬态瑞利面波技术的推广应用奠定基础[5]。瑞利面波的传播示意图：图2-2时间空间域中可视的瑞利面波纪录面貌：图2-32.2野外工作方法应用瞬态法进行现场测试时一般采用多道检波器接收，以利于面波的对比和分析。当锤子或落重在地表产生瞬态激振力时，就可以产生一个宽频带的R波，这些不同频率的R波相互迭加，以脉冲信号的形式向外传播。当多道低频检波器接收到脉冲形振动信号后，经数据采集，频谱分析后，把各个频率的R波分离出来，并求得相应的VR值，进而绘制面波频散曲线[6]。当选取两道检波数据进行反演处理时，应使两检波器接收到的信号具有足够的相位差，其间距△x应满足（λR/3）～λR，即在一个波长内采样点数要小于在间距△x内的采样点数的3倍，而大于在间距△x内的采样点数的1倍，该采集滤波原则对于不同的勘探深度及仪器分辨率和场地地层特性可作适当调整。当采用多道检波数据进行反演处理时，虽然不受道间距公式的约束，但野外数据采集时也应考虑勘探深度和场地条件的影响。一般来说，当探测较浅部的地层介质特性时，易采用小的△x值并用小锤作震源以产生较强的高频信号，即可获得较好的结果；当探测较深部的地层介质特性时，易采用较大的△x值，并用重锤冲击地面，以产生较低频率的信号，使其能反映地下更深处的介质信息，达到岩土工程勘察之目的。震源点的偏移距从理论上讲越大越好，且易采用两端对称激发，有利于R波的对比、分辨和识别，但偏移距增大就要求震源能量加大和仪器性能的改善。一般来说，偏移距应根据试验结果选取。就目前的仪器设备条件和反演技术水平，选用偏移距20～40m即可获得较好的测试结果。由多道检波数据反演处理后可得一条频散曲线，一般把它作为接收段中点的解释结果。实际上该曲线所反映的地层特性为接收段内地层性质的平均结果，故当探测场地地下介质水平方向变化较大时，只要能满足勘探深度的要求，尽量使反演所用的接收段减小，以使解释结果更具客观实际[7]。2.3测线布置工区位于抚州市温泉乡余山水库西南向，与石禾岗相连。综合考虑，在水库的大坝上进行测量。（见图2-4）沿大坝的西南向布置大概长500米的测线，选用多道检波器进行该工区的面波测量，从而找到F5和F6的构造带和浅层地表的地质情况。图2-4测线位置图2.3.1主要的仪器设备及其设置的参数1.工作所需要的仪器设备如下表：表1主要的仪器设备1SWS-3地震仪24HZ的检波器（24个）312道的大缆2条418磅的大锤和铁板（各两个）5连接线2条6测绳一根2.仪器所设置的参数见表2：记录道数每道采集数采样时间间隔偏移距道间距2410240.250ms10m1m表2选用的参数2.3.2仪器要求1仪器放大器的通道数不应少于12通道。采用的通道数应满足不同面波模态采集的要求。2仪器放大器的通频带应满足采集面波频率范围的要求。对于岩土工程勘察，其通频带低频端不宜高于0.5Hz，高频端不宜低于4000Hz；3仪器放大器各信道的幅度和相位应一致：各频率点的幅度差在5%以内，相位差不应大于所用采样时间间隔的一半；4仪器采样时间间隔应满足不同面波周期的时间分辨，保证在最小周期内采样4至8点；仪器采样时间长度应满足在距震源最远通道采集完面波最大周期的需要；2.3.3采集系统的布置使用SWS-3进行面波测量，首先拉好测绳，按找道间距1m布置好2条大缆，仪器放在两条大缆的中间连接处，并且连好每道的检波器。然后使用连接线把大锤和铁饼与仪器连接好，作为触发器，偏移距为10m。最后检查检波器以及连接线的接头是否正常，再开机进行参数设置。参数设置好后进行数据采集，每个布置好的测点两侧各放一次炮，采集两次数据之后再移动采集系统，直至测完整个大坝。连接方法见图2-5：图2-5采集系统布置图2.3.4使用规范本次工作依照以下技术规范进行：1.《多道瞬态面波勘察技术规程》2.《多道瞬态面波勘探标准》3.《岩土工程勘察规范》（GB50021-2001）；4.国家执行标准《电力工程物探技术规定》（SDGJ81-88）实行2.4野外数据采集多道瞬态瑞利面波勘探现场数据采集与常规地震勘探使用的多道观测系统相同[8]，这与稳态法和早期只有两道的采集系统相比更加方便快捷，并且可以在时间剖面上准确识别瑞利波所在的时间空间位置，合理设计观测“窗口”。为了取得高质量的现场观测数据，还需注意以下问题：（1）使用宽频带的脉冲震源低频瑞利波的传播特征反映了深层的信息，高频分量的特征则反映了浅层信息。在工程中常需要对地下几十米内的土体进行分层，这就需要使用脉冲震源有足够宽的频带。（2）选择匹配的检波器在理想情况下瑞利波勘探用检波器的频响特性应有从0HZ到数百甚至千赫的宽频特性，这在实际中是达不到的，可以结合使用不同固有频率的检波器，如4Hz、38Hz和100Hz（本次工作用4Hz检波器）。（3）采集过程中最好不要进行滤波滤波会损失瑞利波携带的有用信息，同时，瑞利波勘探中，希望滤波处理不改变数据的相位特性，但现有的滤波处理程序都会产生一定的相移，从而对瑞利波频散曲线的计算产生不利影响。（4）选择合适的观测系统参数观测系统参数包括时间采样率、采样长度、道间距、偏移距、记录道数等，应根据勘探目的层的深度、厚度或目标体的尺寸确定观测系统参数。一般说，展开排列长度应不小于最大勘探深度，道间距应不大于研究的最小地层的厚度[9]。图2-6野外数据采集东华理工大学毕业设计（论文）数据处理3.数据处理3.1处理方法和原理面波数据处理按其算法一般分为时间域与频率域两大类。目前频率域的处理多进行f－K域（频率波数域）的变换，因为面波的各个模态，在时间和距离上往往是相互穿插叠合的。在f－K域中，可以清楚地区分开面波不同模态的波动能量，从而能够单一地提取出基阶模态的频散数据[10]。运用二维傅立叶变换，可以将时间距离域的弹性波场数据，转换为频率波数谱数据，表示为二维坐标中的图形。一般其左上角为坐标原点，纵坐标为频率轴，沿纵坐标向下波动频率增高，也就是在时间上波动越快。横坐标为波数轴，沿横坐标向右波数增多，也就是在空间上波长越短。各个波动组份谱振幅的大小，用不同颜色的色标来表示,一般色度越亮，表示谱振幅越大。波动组份坐标点(f－K)和原点联线的斜率(f/K)，体现了它的相速度。这条联线越陡，说明该波动组份的相速度越大，而越平缓则说明相速度越小[11]。3.2数据处理内容面波数据资料预处理、生成面波频散曲线、频散曲线分层反演剪切波速度及确定层厚，利用面波频散曲线生成速度映像彩色剖面，并在此基础上绘制地质剖面图等。3.3处理软件要求资料处理软件为SeisImager处理系统，具体要求如下：1.采集参数的检查与改正、采集文件的组合拼接、成批显示