国家自然科学基金完整的标书范文

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20**年国家自然科学基金面上项目题目：研究真核起始因子X-Y轴调控糖基转移酶对肠癌肝转移的作用机制摘要：大肠癌手术后复发转移中，肝、肺转移是最常见的转移模式，但其机制一直未能阐明。在前期研究中，我们建立了大肠癌远处转移的特征分子谱式，发现真核起始因子Z家族的成员X和Y在肝转移中具有关键调节作用。X-Y轴能够介导大肠癌肝转移的发生，X可促进细胞获得运动能力，并在转移灶中通过Y的相互作用促进细胞异常增殖。进一步实验表明，X能调节下游糖基转移酶，可能激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，从而通过与肝细胞膜上特异性受体相互作用而使肠癌细胞“定居”于肝脏。可见，X-Y调节轴对于大肠癌肝转移至关重要。本项目拟在此基础上，从大样本回顾性分析中总结X-Y对于结肠癌肝转移的临床相关性和预后判断价值。同时，在细胞和动物模型中进一步深入探讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制，解析下游效应途径及靶点。一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：一、立项依据大肠癌是一种发生在结肠或直肠中的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病人约八百万，占所有恶性肿瘤的10%-15%，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第三位。随着手术、化疗、放疗水平的提高，大肠癌患者的生存率有了较大的提高，但远处转移是影响其预后的最主要因素。在美国大肠癌中有90%的死亡由肿瘤的远处转移所致。因此，通过研究大肠癌转移机制，正确认识大肠癌术后转移模式，制定合理的术后随访方案，采取有针对性的干预措施，提高生存率至关重要。我们的研究关注于肝转移中的特异分子标志，其中两个成员属于真核起始因子Z家族：X和Y。Z真核起始因子在真核生物翻译起始过程中起着重要作用，但其在肿瘤中的作用尚不清楚。我们发现Y基因在大肠癌细胞中高表达，其表达被干扰后，细胞增殖能力显著抑制，细胞凋亡比例提高。考虑到X与Y之间存在相互结合，我们进一步观察了两者之间的交互作用。有意思的是，X对于Y的促恶性增殖功能是必需的，表现在沉默X表达之后，过表达Y对大肠癌细胞的增殖调控失活。我们提出科学假设：真核起始因子X-Y轴能够调控大肠癌肝转移的发生，X可介导细胞获得运动能力，并且在转移灶中调节Y发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用，具体作用机制有待阐明。在哺乳动物中，Z因子的亚基有8种，按分子量从大到小排列而命名。Z因子参与真核细胞翻译过程，而调节蛋白合成在维持细胞生长控制中起重要作用。Z因子不仅能通过促进mRNA与40s亚基结合，而且还可以独自与游离的40s亚基结合，影响40s亚基与60s亚基及其他亚基蛋白的结合或解离。Z家族成员一般含有PCI和MPN结构域，这两类结构域都参与蛋白-蛋白相互作用，部分还具有RNA识别结构域，可能参与RNA的结合。除此之外，Z因子还被发现具有调控细胞周期的作用。通过调节不同类型的mRNA的翻译起始，Z因子就可以选择性地调控蛋白的合成，从而对肿瘤细胞的生长的转移等生物学行为进行调控。Z家族中部分成员已证实在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，已报道的包括：A、B、C、D等。Y的致癌作用由申请人首先报道，随后其在胶质瘤和呼吸系统肿瘤中的作用也被其他研究者发现。而关于X与恶性肿瘤的关系目前还未见文献报道，可见在针对X、Y两个分子尤其是交互作用方面，申请人尚居于领先的研究地位。早期的研究表明，X在包含Y蛋白的复合物与40S核糖体亚基结合的过程中扮演着关键的链接作用。缺失X时，两者的结合不稳定，并会降低翻译起始系统的调节能力。最近的研究表明，W可以与X竞争性地结合Y，形成不同的Z复合物。这些Z复合物可以招募tRNA或mRNA，从而调节下游基因表达，进而影响肿瘤细胞的生长、迁移等生物学过程。在最近的研究中，我们进一步深入探讨了X的调控机制。我们发现，在敲减X后，肠癌细胞中多个关键调控节点发生了改变，其中包括3个半乳糖基转移酶（β1,3-GalT;β1,4-GalT-1;β1,4-GalT-7）的表达降低。糖基化是一种常见的蛋白翻译后修饰，参与细胞增殖、分化、转移、侵袭、免疫应答等多种生命活动。糖基化紊乱可以导致多种肿瘤的发生和恶性转化，而糖基转移酶的表达和活性与包括大肠癌在内的多种肿瘤的恶性化程度相关。之前的研究表明，β1,4-半乳糖基转移酶1可以通过调节EGFR影响肝癌细胞的生长和凋亡，而β1,4-半乳糖基转移酶3可以通过调节整联蛋白信号通路影响神经细胞瘤的侵袭能力。此外，半乳糖基转移酶的激活可以使细胞膜上蛋白糖基化程度增加。这些发现表明，X的调控机制可能通过影响半乳糖基转移酶的表达和活性，从而影响肿瘤细胞的生长和转移。试建立预测模型，评估其临床预后价值。2)利用肠癌细胞株和动物模型，探究X-Y调节轴在肠癌肝转移中的作用机制，重点研究X对半乳糖基转移酶的调节作用及其与肝细胞表面特异性受体ASGPR的相互作用，进一步明确X-Y调节轴的信号通路和作用靶点。2、研究目标1)明确X-Y调节轴在结肠癌肝转移中的作用机制，揭示其内在调节机理，为肠癌预后的判断和治疗提供新的理论依据。2)建立X-Y表达水平与肠癌肝转移的预测模型，为临床预后评估提供参考。3)探究X对半乳糖基转移酶的调节作用及其与ASGPR的相互作用，为开发新的肝转移靶点提供思路。3、拟解决的关键科学问题1)X-Y调节轴在结肠癌肝转移中的作用机制是什么？其内在调节机理是什么？2)X-Y表达水平与肠癌肝转移的预测模型的准确性如何？是否可以在临床应用中发挥作用？3)X对半乳糖基转移酶的调节作用及其与ASGPR的相互作用机制如何？是否可以作为新的肝转移靶点？本研究旨在建立基于X、Y表达的分子预测模型，并评价其在临床上的适用价值。为此，我们将在肠癌细胞株中过表达和沉默X、Y基因，观察细胞功能变化，并进一步应用裸鼠成瘤和肝转移动物模型进行验证，以观察X、Y对于肠癌恶性增殖和转移发生的影响。通过细胞、动物和组织水平的研究数据，我们将阐明X、Y在肠癌发生和进展中的功能作用。在研究过程中，我们将重点阐明X与糖基转移酶之间的调控关系和作用靶点，X与细胞运动性信号通路靶分子的调节关系，Y复合物调节的信号通路与效应分子，以及X与Y相互结合的序列位点和精细调控。通过这些分析结果，我们将进一步探讨X调节大肠癌肝转移模式的具体作用机制。本研究的第一个关键科学问题是X和Y在大肠癌肝转移中的临床意义。我们将通过大样本组织中检测这两个分子的表达，并利用病理和随访数据进行统计分析，以获得多因素条件下这两个靶标的临床价值。为此，我们将建立规范化的组织样本库，并积累随访数据，运用统计方法进行分析。在方法学上，我们将采用商业化抗体进行检测，不存在困难。通过本研究，我们将深入探讨X-Y轴在调控大肠癌肝转移中的作用机制，为肠癌的治疗和预防提供新的思路和方法。本课题的第二个关键问题是X-Y轴在大肠癌肝转移中的调控分子机制。我们需要阐明Y介导的迁移功能及糖基转移酶信号途径的效应分子和作用方式，并确认Y与X结合的精细调控及促进肿瘤细胞增殖的分子机制。这方面的工作依赖于扎实的前期工作。首先，我们已经得到了Y和X沉默后功能表型的结果。即Y可调控细胞增殖，而X能够调节细胞迁移，并影响Y对肿瘤的促增殖作用。在此基础上，我们将有的放矢地进行机制研究。其次，我们已筛查和验证到X可通过调节两个糖基转移酶对肠癌细胞肝脏种植起到调节作用。在本课题中，我们需要深入研究的是揭示X如何调节细胞迁移功能，其下游调节糖基转移酶是否与肝脏特异性的转移相关，以及它们具体的作用机制是怎样的。在逻辑清晰的机制通路假设中，我们只需逐条验证，即可真正揭开X作用通路的神秘面纱。最后，Y和X之间的cross-talk有创新性且立足于前期研究的数据支持。只需将X-Y复合物调节的位点和下游与细胞增殖功能相关的机制阐释清楚，即可形成完成的研究故事。考虑到肿瘤细胞增殖机制方面报道众多，可参考模式丰富，这方面的研究也不会有太大的科学风险。三、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1.技术路线我们将采用基因芯片鉴定X、Y在肠癌肝转移组织中特异性高表达。然后，我们将使用Y基因RNAi慢病毒感染和X基因RNAi慢病毒感染来降低它们的表达。我们已经得到了Y沉默后SW1116细胞增殖能力显著降低的结果。而X沉默后SW1116细胞增殖被抑制，迁移能力显著降低。我们还将使用X基因过表达慢病毒感染和Y基因过表达慢病毒感染来提高它们的表达。我们已经得到了Y沉默后，过表达X，SW1116细胞增殖有稍许增强的结果。而X沉默后，过表达Y对SW1116细胞增殖、迁移无显著影响。我们认为X-Y轴可能调控大肠癌肝转移的发生。因此，我们将使用裸鼠移植瘤模型来验证这个假设。我们还将使用基因芯片筛选X沉默后下游分子变化。我们认为半乳糖基转移酶可能是X调节肠癌细胞肝转移模式的关键。因此，我们将使用裸鼠肠癌肝转移模型来验证这个假设。我们将使用qPCR、WB验证X对半乳糖基转移酶的调控。我们还将使用EMSA/Co-IP实验来验证X-Y的RNA/蛋白相互作用。我们将对X的序列进行分段，分别构建载体，用Co-IP的方法检测与Y结合的区域。我们还将对目标序列区域进行分析，设计点突变，验证XY结合的位点。我们将收集500例肠癌组织和肝转移组织样本。然后，我们将使用免疫组化检测X、Y蛋白表达和定位。最后，我们将根据临床的病理资料/预后和随访资料分析X、Y表达对肠癌预后的临床意义，以及对肠癌细胞体内成瘤能力的影响。InvivonoftheX-YaxisintheXXXbeta-1,4-galactosyltransferase.2.ResearchMethods2.1XXXofXandYintheXXX.1)Retrospectivelycollectedclinicalspecimensof500casesofcoloncancer。includingsurgicalresectedcoloncancertissues。matchedlivermetastases。andXXX200cases。andparaffinblockswerepreparedfor300cases。Allcaseswerediagnosedclinically。graphically。XXX。andnopreoperativeadjuvanttreatmentwasperformed。ThecaseswereXXXeen2008and2013.andfollow-updatawerecomplete.2)XXXissuens。withnegative。tumor。andXXX.3)SPSS16.0arewasusedtoXXXanalysisonthenandnofXandYandclinicalXXXXandYXXXusclinicalfactors。XandYn。coloncancerlivermetastasis。XXX。andprognosis.2.2XXXoftheXandYgenesinXXX.1)PreparedX-XXXX-silencedcelllines。withXXXwereusedtoobservethegrowthcurveofcellsafterXsilencing。andcloneXXX。Atthesametime。alentivirusvectoroverexpressingXwasprepared.2)InstableX-silencedcoloncancercells。XXX。instableY-silencedcoloncancercells。alentivirusvectoroverexpressingXwasXXX.3)XXXtheeffectofYandXontheinvivoXXXXXXgroupsincludedblankcontrols。Y-silencedgroups。X-silencedgroups。X-silencedgroupswithYn。andY-XXX.计合适的引物，制备X和Y的蛋白质表达并纯化，然后进行电泳迁移实验，观察X和Y之间的结合情况。通过改变反应条件，如添加竞争性DNA或反应体系中添加不同浓度的盐，进一步验证X和Y之间的相互作用关系。建立结肠癌肝转移动物模型，观察肝脏中的转移灶，统计分析Y和X对结肠癌肝转移能力的影响，明确Y和X在结肠癌肝转移过程中的作用。实验分为空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。利用qRT-PCR和免疫组化方法检测Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表达，制备部分肿瘤组织成冰冻切片，利用FITC和TRITC双标记免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜观察X与Y的共定位情况。通过基因芯片Microarray分析X过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确X消减后表达发生改变的下游调控分子，芯片结果中有显著差异的潜在作用分子，设计引物，通过qRT-PCR进行二次表达验证。ork、orks、ork重建，解析X调控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建X为核心的信号分子网络。根据X基因沉默后影响的信号通路结果（半乳糖基转移酶及其上游调节信号通路），利用信号通路抑制剂处理X稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细胞，检测不同分子信号对X表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对X在结肠癌中的功能表型的影响。采用信号通路高通量检测蛋白芯片，根据以上实验分析的通路情况，订购相应通路的PathwayArray试剂盒，检测X基因表达变化后的特定通路关键蛋白的变化。分别构建X、Y的真核表达载体，共转293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）验证XY的相互结合作用。应用生物信息学技术模拟X与Y的结合位点，制备不同氨基酸的突变体，采用RNAi方法敲减互作蛋白表达，接着转入互作蛋白的突变体，检测细胞功能表型变化。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证X与Y之间的结合位点特异性。进行EMSA实验验证X与Y之间的相互作用关系，设计合适的引物，制备X和Y的蛋白质表达并纯化，然后进行电泳迁移实验，观察X和Y之间的结合情况。本研究旨在研究X作为Y调节蛋白对下游RNA进行调控的精细机制。为了确保研究目标的可行性，我们进行了大量的预实验，并且已经证实了Y可以调节结肠癌的恶性增殖。本项目是对前期研究工作的进一步补充和完善，具有较好的可行性。我们的课题组成员长期从事结直肠癌的诊治和发生发展机制研究，具有丰富的经验和扎实的研究基础。我们使用的实验技术也都是我们之前已经涉及过的，所需的主要仪器设备也已经具备。此外，我们的课题组成员大部分为中青年业务骨干，每个人均有自己的研究专长，能保障本