第3章-质谱技术与质谱仪

第3章质谱技术与质谱仪3.1概述3.2质谱仪的基本原理3.3质谱仪的基本结构3.4质谱仪的主要性能指标3.5质谱图及其判读3.6生物质谱技术简介3.1概述一、方法概述

质谱法以某种方式使带电原子、分子或分子碎片电离、碎裂，然后按照质量或质荷比（m/z）大小检测它们的强度，并将其排列成谱，这种研究物质的方法称作质谱法。

质谱仪就是将待测物样品在一定条件下转化成气态离子，并通过质量分析器，按其质荷比大小顺序进行分离记录的分析仪器。

这种按质量或质荷比大小顺序排列而成的图谱就是质谱图。二、质谱图上提供的信息1、物质的相对分子质量；2、物质的结构信息;结构不同，分子的碎片不同质荷比也不同；正癸烷

1、1913年，Thomson使用MS发现了Ne是由22Ne和24Ne两种同位素组成，随后，同位素分析开始发展。

2、20世纪30年代末至40年代，由于石油工业的发展，需要测定油的成份。将MS用于石油工业中烃的分析，大大的缩短了分析时间。

3、50年代到80年代，质谱仪器开始商品化，并广泛用于各类有机物的结构分析；同时质谱方法与NMR、IR、气相色谱等方法结合成为有机物结构分析的最有效的手段。4、90年代以后，发展了新的离子化源使得质谱仪能满足一些生物分析的需要，2002年诺贝尔化学奖授予约翰.芬恩（美国）；田中耕一（日本）；以表彰他们发明了对生物大分子的质谱分析法。三、发展历史四、突出特点1.质谱法是唯一可以确定分子质量的方法；2.灵敏度高；3.样品用量少，通常只需微克级样品，检出限可达10-14g；4.质谱仪种类很多，应用范围广，可进行同位素分析，也可进行化学分析，可进行无机成分、有机结构分析，生物样品分析；被分析对象：气体、液体、固体。3.2质谱仪的基本原理

进入进样系统的气态样品分子在离子源中被转化成离子，离子束经加速后飞入磁极间的弯曲区，由于磁场作用，飞行轨道发生弯曲，此时离子受到磁场施加的向心力作用，同时离子还受到离心力的作用，当两力平衡时，离子飞出弯曲区。其中B为磁感应强度，ze为电荷，

为运动速度，m为质量，r为曲率半径。又因：调整后可得：

通过改变B、r、U三个参数中的任一个就可将不同质荷比的离子分开。如保持B、U

不变，离子的质荷比与半径的平方成正比；现代质谱仪一般是保持U、r不变，通过改变电磁场来获得质谱图。

由于样品离子的质荷比不同，离子通过同样的电场加速后所获得的速度也不同，从而在磁场中就会发生不同程度的偏转，它们被离子捕集器捕集，并通过显示器显示出来的系列技术就是质谱技术。Agilent7500系列ICP-MS3.3质谱仪的基本结构进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光

1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆

质谱图真空系统样品3.3.1质谱仪的结构框图3.3.2各部分的组成与作用1、真空系统质谱仪中离子的产生及经过系统必须处于高真空状态。其中，离子源中的真空度：1.3×10-4-1.3×10-5Pa，质量分析器中的真空度：1.3×10-6Pa

一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。高真空的作用：

a）避免离子源灯丝损坏；

b）减少引起其它分子离子反应，避免质谱图的复杂化；

c）防止用作加速离子的几千伏高压引起放电。

2、进样系统进样系统的作用是高效重复地将样品引入到离子源中，并且不能造成真空度的降低。常用的进样装置有：间歇式进样直接探针进样色谱进样系统（GC-MS、HPLC-MS）高频感藕等离子体进样系统（ICP-MS）注入样品(10-100

g)—贮样器(1L-3L)—抽真空并加热—样品蒸汽分子(压力陡度)—漏气小孔—高真空离子源1.3-0.13Pa（加热）1）间歇式进样：适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。优点：引入样品量小至1ng，在生物质谱分析中用得最多。2）

直接探针进样：探针杆通常是一根规格为25cm6mm，末端有一装样品的黄金杯(坩埚)，将探针杆通过真空闭锁系统引入样品，如图所示。高沸点液体及固体3)色谱进样系统：利用气相和液相色谱的分离能力，与质谱仪联用，进行多组份复杂混合物分析。其中色谱进样系统中用得最多的是六通阀。a)取样位b)进样位六通阀的结构及样品导入原理六通阀的样品导入方式：当旋转式六通阀处在取样位时，用注射器将样品从①处注入定量管，多余的样品从②处排出作为废液，当六通阀处在进样位时，样品在流动相的携带下进入进样系统。①⑥②③④⑤其中的取样位与进样位由二位三通电磁阀来决定。二位三通电磁阀不通电取样位：PA通、AT不通通电进样位：PA不通、AT通路3、电离源

电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。离解方法根据分子离子化所需要的能量大小不同分为硬电离方法和软电离方法。提供较大能量的电离方法为硬电离方法，提供较小能量的电离方法为软电离方法。软电离方法适用于易破裂或易电离的样品，如生物大分子等。常见的几种离子化方式如下表名称简称类型离子化试剂电子轰击源EI气相高能电子化学电离CI气相试剂离子场电离FI气相高能势电极场解吸FD解吸高能势电极快原子轰击FAB解吸高能电子电喷雾电离ESI解吸高场基质辅助激光解吸电离MALDI解吸激光辐射1）电子轰击源

电子轰击法是常用的电离法，它使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子的方法。

式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子。

当电子轰击源具有足够高的能量时(一般为7OeV)，大多数化合物（电离能为10eV）分子不仅可能失去一个电子形成分子离子，而且有可能进一步发生键的断裂，形成大量的各种低质量数的碎片正离子和中性自由基，这些碎片离子可用于化合物的结构鉴定。

如图，在离子源内，用电加热锑或钨的灯丝到2000℃，产生高速电子束，其能量为10-7OeV。当气态试样由分子漏入孔进入电离室时，高速电子与试样分子发生碰撞，导致试样分子电离而产生正离子。2）化学电离源化学电离法是通过离子-分子反应来进行，而不是用强电子束进行电离。化学电离的原理：用一种小分子的离子，如甲烷、丙烷、氨以及水蒸气的离子等轰击试样分子。首先用高能电子轰击CH4，使CH4电离产生CH4+·和CH3+，即：CH4+e

CH4+·+2eCH4+·

CH3++H·CH4+·和CH3+很快与大量存在的CH4分子起反应，即：

CH4+·+CH4

CH5++CH3·CH3++CH4

C2H5++H2生成的CH5+和C2H5+就不会再与中性甲烷进一步反应。一旦小量样品（试样与甲烷之比为1

1000）导入离子源，试样分子（RH）发生下列反应：

CH5++RH

RH2++CH4

（[M+1]+）

C2H5++RH

R++C2H6（[M-1]+）

RH2+

和R+然后可能碎裂，产生质谱。由[M+1]+或[M-1]+离子很容易测得其相对分子质量。4、质量分析器

质谱仪的质量分析器位于离子源和检测器之间，它的功能是利用不同方式将样品离子按质荷比m/z

大小分开。质量分析器的主要类型有：磁分析器（单聚焦质量分析器，双聚焦质量分析器）、飞行时间分析器、四极滤质器等。具有不同的方向，也就是说，发射角度不同具有不同的动能

如何区分质荷比相同，但是具有不同发射角和不同的动能的离子？具有相同质荷比的离子在进入入射狭缝时？？（1）单聚焦质量分析器：它由单个扇形（90o或60o）或半圆形（180o）的均匀磁场组成。（2）双聚焦质量分析器：它在离子源与磁场之间增设一个静电分析器，其工作原理图如下：

当离开入射狭缝的离子束在穿过静电分析器的环形通道时，离子所受到的向心力等于离心力时有：所以，离子运动的轨道半径r可通过外加静电场来加以控制，只有动能相同的离子才能通过中间狭缝，实现能量聚焦。具有不同的方向，也就是说，发射角度不同具有不同的动能具有相同质荷比的离子在进入入射狭缝时可以采用单聚焦质量分析器聚焦于出射狭缝采用单聚焦质量分析器不能完全聚焦于出射狭缝要采用双聚焦质量分析器它是一种无磁动态质量分析器，根据不同质荷比的离子在无场分离区中的速度不同，引起漂移时间的差异来实现分离。（3）飞行时间质量分析器(TOF)反射型直线型飞行时间质量分析器如下图，由灯丝发射出的电子在电场作用下射向阳极，运动中央的电子在离子化区与气体分子碰撞并使之电离，在电子控制极上施加一个不大的负脉冲电压，引出离子化区中的正离子，在加速区上加直流负电压，使离子得到加速而获得动能，以速度v飞越长约1m的无场漂移区。直线型飞行时间质量分析器的工作原理其速度v为：

由此可见，

t取决于m/z

的平方根之差。也就是说，离子的质量越小，运动速度越快，运行时间也就越短，也就越早到达接收器。此离子达到无场漂移管另一端的时间为：故对于具有不同m/z的离子，到达终点的时间差：（4）四极杆滤质器

它由四根互相平行的金属电极组成，如下图所示。四电极以对角线相连分成两组。电极的截面为对称的双曲面，当离子进入此四极杆滤质器中时，只有合适质荷比的离子才能穿过对准四极杆之内的准直小孔。5、检测与记录质谱仪中常用的检测器有法拉第杯、电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。现代质谱仪中的检测器常采用隧道电子倍增管。

现代质谱仪的记录一般都采用较高性能的计算机对产生的信号进行快速接收与处理，同时通过计算机可以对仪器条件进行严格的监控，从而提高精密度和灵敏度。

3.4质谱仪的主要性能指标3.4.1质量范围3.4.2分辨率3.4.3灵敏度3.4.1质量范围

它是指质谱仪能够进行分析的样品的相对原子质量范围，以原子质量单位来进行计量。一个原子质量单位（1u）就是处于基态12C中性原子的质量的1/12。

质谱仪的质量检测范围为，

一般气体：2-100u；有机物:30-3000u；生物大分子：>400000u3.4.2分辨率

它是指质谱仪能分辨的两个最小质量差的质谱峰的能力。如果两个峰相应的质量分别为m1和m2，那么分辨率R=m1/(m2-m1)=m1/m质谱仪的分辨率,

对一般分析：R=500；对同位素及有机物：R>10000;例如：[C24H19N]+:m1321.1513;[C21H23NS]+:m2321.1546；R=M/

M=321/(321.1546-321.1513)=97273

m↓,R↑;m越小，R越大，分辨率越高；一般规定，两峰间峰谷高度小于两峰高的10%，就能进行分辨。3.4.3灵敏度

质谱仪的灵敏度有绝对灵敏度、相对灵敏度和分析灵敏度。绝对灵敏度：仪器可以检测到的最小样品量；相对灵敏度：仪器可同时检测的大组分与小组分的含量比值；分析灵敏度：输入仪器的样品量与仪器输出的信号的比值。

Voyager-DE-STR型MALDI-TOF质谱仪的灵敏度可达10-15mol级。3.5质谱图及其判读3.5.1质谱图上离子的主要类型3.5.2各类有机化合物的断裂规律及质谱图3.5.3MS的应用1、分子离子峰试样分子在高能电子撞击下产生正离子，即；

M+为分子离子或母体离子。分子离子的质量与化合物的分子量相等。3.5.1质谱图上离子的主要类型

一般有机分子的电离电位在7-15eV，几乎所有的有机分子都有可以辨认的分子离子峰。芳香环分子可产生较强的分子离子峰；高分子量的脂肪醇、醚及胺等产生较小的分子离子峰；若不考虑同位素的影响，分子离子峰一般具有最高质量。

分子离子峰的稳定性越大，那么质谱图上对应的分子离子峰越高。有机化合物分子离子峰的稳定性顺序：芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇分子离子峰：质谱图上质荷比最大的峰

a)Ｎ律由Ｃ、Ｈ、Ｏ、X（卤素）组成的有机化合物，Ｍ一定是偶数。由Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ组成的有机化合物，Ｎ奇数，Ｍ奇数；Ｎ偶数，Ｍ偶数。

b)与邻近的峰相差是否合理分子离子不可能裂解出三个以上的氢原子和小于一个甲基的基团，故分子离子峰的左面不可能出现小于3～14个质量单位的峰。2、碎片离子峰分子离子产生后可能具有较高的能量，将会通过进一步碎裂或重排而释放能量，碎裂后产生的离子形成的峰称为碎片离子峰。碎片离子峰的峰高与化学键断裂及分子结构有关，碎片离子峰越稳定它的峰高也越高。烯烃多在双键旁的第一个键上开裂：

烷烃化合物断裂多在C-C之间发生，且易发生在支链上：如：正己烷3、亚稳离子峰

若质量为m1的离子在离开离子源受电场加速后，在进入质量分析器之前，由于碰撞等原因很容易进一步分裂失去中性碎片而形成的m1+m2+△m这种亚稳离子峰的表观质量用m*表示，它与m1、m2的关系为：m*=（m2）2/m1

式中m1为母离子的质量，m2为子离子的质量。亚稳离子峰具有离子峰宽（约2-5个质量单位）、相对强度低、m/z不为整数等特点，因而很容易从质谱图中观察。例如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2分子离子峰同位素离子峰

因为，在甲烷中，I17/I16=0.011。所以，在丁烷中，出现一个13C的几率是甲烷的4倍，则分子离子峰m/z=59、58的强度之比I59/I58=4×0.011=0.044；4、同位素离子峰

有些元素具有天然存在的稳定同位素，会在质谱图上出现一些M+1，M+2，M+3的峰，由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰。同位素离子峰相对峰高取决于分子中同位素的种类、数量和丰度。

CHCHCHCZHR1R2R3R4CHCHR3R4HCCZHR1R2

5、重排离子峰

在两个或两个以上键的断裂过程中，某些原子或基团从一个位置转移到另一个位置发生重排，并丢失掉中性分子或碎片后而形成的离子，称为重排离子。质谱图上相应的峰为重排离子峰。其中最常见的一种是麦氏重排。这种重排形式可以归纳如下：

可以发生这类重排的化合物有:酮、醛、酸、酯、含P=O，＞S=O的化合物、烯烃类和苯类化合物等。BAHDR++HDRBA+

邻位效应

邻位效应发生的条件:苯环上有邻位取代基

D为杂原子

A原子上有H麦氏重排条件：存在邻位效应碎片离子重排裂解碰撞裂解

设一有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子源，受到电子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子如下：举例：分子离子3.5.2各类有机化合物的断裂规律一、分子的离子化分子进行离子化时，电离电位最低的电子最容易失去

失电子的顺序为：

如丙酮：二、断裂方式2、异裂：一个

键的两个电子裂开后，两个电子都归属于其中某一个碎片，即：有机化合物的断裂方式有两种类型：均裂、异裂。

1、均裂：一个

键的两个电子裂开，每个碎片上各保留一个电子。即：烯烃，电离时失去一个π电子

烷基苯的苄基断裂

含饱和官能团的化合物：如胺、醇、醚、硫醇、硫醚、卤代物等

3、与碎片有关的化学键的强度（焦耳键能的大小）键能越小，越容易断裂键类型C-CC-NC-OC-SC-HC-FC-ClC-BrO-H单键双键叁键3456078353046158893597482725354094853382844622、破碎产物的稳定性1）正碳离子的稳定性2）π电子对正电荷有稳定作用，如苄基正离子、烯丙基正离子等。3）与碳原子相邻的杂原子对正电荷有稳定作用3.5.3MS的应用一、分子式的确定1、利用同位素的丰度推导分子式（1）分子中氯、溴元素的识别

氯、溴均有A+2的同位素，因而出现M+2峰。如果分子中只有一个卤素原子，则M与M+2的峰强度比为氯3：1和溴1：1。

如分子中含有多个卤素原子，则间隔两个质量数的质谱峰强度比为（a+b)n的展开式各项之比。a和b分别是两种同位素的丰度比。

如分子中既有氯也有溴，则用（a+b)n（c+d)m来计算。

分子中碳原子数越多，13C出现的几率越高，M+1峰的高度也越高。可利用下面的公式来计算分子中C原子的数目。（2）分子中碳原子数目的确定

碳有13C同位素，其丰度为1.1%，是A+1类同位素中丰度最大的，且碳是组成有机化合物最基本的元素。利用Beynon表查阅可能的分子式

Beynon等人利用同位素丰度以及M、M+1、M+2离子峰的丰度比计算出可能的分子式（只含C、H、O、N），制成Beynon表。二、分子结构的推测第一步、根据质谱图确定分子量第二步、研究质谱图的概貌，判断分子离子的稳定性第三步、根据重要的低质量离子推测物质的类型第四步、与标准物质的质谱对照例1:根据以下MS图谱推测化合物的结构182：C13H12N、C13H10O、C13H26、C14H24105：C7H7N、C7H5O77：C6H551：C4H3CO苯环特征离子1）分子量为128，不含氮或含偶数个氮；2）出现43、57、71等峰，CnH2n+1或CnH2nCO，而无30、

44等含氮的特征峰，可认为化合物不含氮；3）无77、65、51等苯基的特征峰；例2:根据以下MS图谱推测化合物的结构4）58、86、100为麦氏重排峰，因而表明分子中有C=O；5）分子式为C8H16O；6）86的重排峰证明失去的是CH2=CH-CH3，即有（CH3）2CHCH2C=O存在；7）分子结构为：3.6生物质谱技术简介3.6.1什么是生物质谱技术？它是根据生物大分子的化学结构特点，采用新型软离子技术和以计算机为基础的专用分析软件，对生物样品进行快速、定性和定量分析的一种技术。应用领域：对各种生物活性大分子如蛋白质、多肽、核酸、多糖的复杂结构进行测定与分析。它是研究蛋白质组学、基因功能组学的重要技术平台之一。3.6.2生物质谱分析的特点IonsourceIonseparatordetector离子资源:采用软电离技术使底物变成离子气质量分析:根据质量/电荷

(m/z)检测:pmol–fmole(10-12–10-15mole)3.6.3生物质谱分析仪的类型MALDI-TOF:基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱ESI:电子喷雾离子化质谱（常与LC,HPLC联用）3.6.4生物质谱的软电离技术1.电喷雾电离：它是样品溶液在高电场下发生静电喷雾并产生离子发射的过程。如图所示，以内径约为0.1mm的不锈钢毛细管作为喷嘴，并施加3-8KV的高电压，在毛细管内的电场强度高达106V/m。当溶液与雾化气体N2一起被泵出毛细管出口处时，发生喷雾，由于其液体微粒带有强电荷，所以称为电喷雾。

2、荷电液滴的蒸发过程

在高电场作用下，液滴中的溶剂迅速蒸发，液珠内的离子向表面移动并积聚，使电荷密度增高，在达到临界点时会分裂成更小的液滴，产生大量携带一个电荷或多个电荷的离子，并以单电荷或多电荷离子的形式进入气相，经聚焦后进入质量分析器；而与样品离子一同穿过毛细管的少量溶剂，由于呈电中性且动量小而在降压区被抽走。

离子蒸发过程示意图它是一种直接气化并使非挥化性样品离子化的技术。原理：先将被测样品悬浮或溶解于一种基质中形成基体，当用337nm的N2激光束扫描基体时，基体能将吸收的能量均匀地传递给样品，使样品瞬间升华并离子化。3、基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质：一类小分子的有机物；样品与基质的摩尔比一般大于1：1000。使用基质的目的：保护样品，减少样品用量；进入时间飞行质量分析器。样品分子在此处与基体分子分离，并按照各自不同的m/e值依次到达检测器而被检测出来。

被离子化后的样品分子在加速下飞过自由漂移区，例如：氨基酸分子的检测原理

？在生物大分子中，目前质谱分析能解决的主要问题是测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链中氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。例如，用质谱法测定多肽和蛋白质的序列是根据其质谱中的碎片离子来推导的。质谱中出现的序列信息碎片主要是通过酰胺键（肽键）断裂所形成，由肽键主链简单断裂而形成的离子按照惯例分成两类：从N端开始以a,b,c表示，从C端开始以x,y,z表示。四肽H2NCHR1CONHCHR2CONHCHR3CONHCHR4COOH代号所含端基假设的结构anNbnNcnNxnCynCznCCID片段的命名法

MALDI-TOF检测的多肽指纹

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidentica