生化工艺课件

培養基製備

培養基製備第一節

工業發酵培養基

第二節培養基的類型及選擇

第三節培養基配製

第四節澱粉水解糖的製備

第五節生化發酵原料

第一節工業發酵培養基

一、工業常用的碳源碳源是組成培養基的主要成分之一。常用的碳源有糖類、油脂、有機酸和低碳醇。在特殊情況下，蛋白質水解產物或氨基酸等也可被某些菌種作為碳源使用,由於菌種所含的酶系統不完全一樣，各自菌種對不同碳源的利用速率和效率也不一樣，如表3-1列出了某些細菌在不同碳源上生物是的得率，從表中可見同樣消耗1克基質，不同碳源得到的菌體相差很多。第一節工業發酵培養基表3-1細胞在不同碳源中的細胞得率碳基團細胞得率（g細胞/g基質）葡萄糖（糖蜜）甲烷正烷烴甲醇乙醇醋酸鹽順丁烯二酸鹽0．

510．

621．

030．

400．

680．

340．36第一節工業發酵培養基葡萄糖是碳源中最易利用的糖，幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作為培養基的一種主要成分，並且作為加速微生物生長的一種有效的糖。但是過多的葡萄糖會過份加速菌體的呼吸，以致培養基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中音代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等導致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。第一節工業發酵培養基糖蜜是制糖時的結晶母液，它是蔗糖廠的副產物。糖蜜含有較豐富的糖、氮素化合物和無機鹽維生素等，它是微生物工業的價廉物美的原料。這種糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50～75%，一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和無機鹽的含量都有所不同，使用時應注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生產中，抗生素等微生物工業也常用它作碳源。在酒精生產中若用糖蜜代甘薯粉，則可省去蒸煮、制曲、糖化等過程，簡化了酒精的生產工藝。第一節工業發酵培養基澱粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它們一般都要經菌體產生的胞外酶水解成單糖後再被吸收利用。澱粉在發酵工業中被普遍使用，因為它利用可克服葡萄糖代謝過快的弊病，同時澱粉來源豐富，價格也比較低廉。常用的澱粉為玉米澱粉，小麥澱粉和甘薯澱粉等。對有些微生物還可直接利用玉米粉、甘薯粉、土豆粉作碳源。麥芽被廣泛使用在啤酒工業中。纖維素和一些野生的含澱粉較多的植物也是今後開發碳源的廣闊天地。它們的成分見表3-2。第一節工業發酵培養基表3-2一些野生植物的化學成分種類水分（%）粗蛋白（%）粗脂肪（%）澱粉（%）灰分（%）橡子鮮蕨根菊芋金毛狗脊石蒜13～225682．711．8/4～7．53．32．51．534．41．5～50．

30．

1//50～602012．542～47．5401．3～32．71．50．840．75第一節工業發酵培養基油和脂肪也能被許多微生物用作碳源和能源。這些微生物都具有比較活躍的脂肪酶。在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解成甘油和脂肪酸，在溶解氧的參與下，進一步氧化成CO2和水，並釋放出大量的能量。因此，當微生物利用脂肪作碳源時，要供給比糖代謝更多的氧，不然大量脂肪酸和代謝中的有機酸積累，會引起培養液pH下降，並影響微生物酶系統的作用。常用的油有豆油、菜油、葵花籽油、豬油、魚油、棉子油等。第一節工業發酵培養基一些微生物對許多有機酸（如乳酸、檸檬酸、乙酸等）有很強的氧化能力。因此有機酸或它們的鹽也能作為微生物的碳源。有機酸的利用常會使pH上升，尤其是有機酸鹽氧化時常伴隨著鹼性物質的產生，使pH進一步上升。不同的碳源在其分氧化時，對pH的影響各不相同。因此不同的碳源和濃度不公對微生物碳代謝有影響，而且對整個發酵過程中pH的調節和控制也均有影響。第一節工業發酵培養基

二、工業常用的氮源氮源主要用於構成菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。1.有機氮源

常用的有機氮源有花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白腖、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒槽等。它們在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌體吸收後再進一步分解代謝。第一節工業發酵培養基有機氮源除含有豐富的蛋白質，多肽和游離氨基酸外，往往還含有少量的糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因數，因而微生物在含有機氮源的培養基中常表現出生長旺盛、菌絲濃度增長迅速的特點，這可能是微生物在有機氮源培養基中，直接利用氨基酸和其他有機氮化合物中的各種不同結構的碳架，來合成生命所需要的蛋白質和其他細胞物質，而無需從糖代謝的分解產物來合成種種所需的物質。有些微生物對氨基酸有特殊的需要。第一節工業發酵培養基有機氮源除了作為菌體生長繁殖的營養外，有的還是產物的前體。例如纈氨酸、半膠氨酸和α-氮基已二酸是合成青黴素和頭孢菌素的主要前體，甘氨酸可作為L-絲氨酸的前體等。2.無機氮源常用的無機氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。微生物對它們的吸收利用一般比有機氮源快，所以也稱之為迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：(NH4)2SO4→2NH3+H2SO4NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH第一節工業發酵培養基反應中所產生的NH3被菌體作為氮源利用後，培養液中就留下了酸性或鹼性物質，這種經微生物生理作用（代謝）後能形成酸性物質的無機氮源叫生理酸性物質。若菌體代謝後能產生鹼性物質的則此種無機氮源稱為生理鹼性物質，如硝酸鈉；正確使用生理酸鹼性物質，對穩定和調節發酵過程的pH有積極作用。例如在制液體曲時，用NaNO3的代謝而得到的NaOH可中和生長所釋放出的酸，使pH穩定在工藝要求的範圍內，又如在另一株黑麯黴發酵過程中用(NH4)2SO4作氮源培養液中留下的SO42-使pH下降，而這對提高糖化型澱粉酶的活力有利。且較低的pH還能抑制雜菌的生長，防止污染。第一節工業發酵培養基氨水在發酵中除可以調節pH外，它也是一種容易被利用的氮源，在許多抗生素的生產中得到普遍的使用，以鏈黴素為例，從其生物合成的代謝途徑中可知：合成1mol的鏈黴需要消耗7mol的NH3。紅黴素生產中也有用通氨的，它可以提高紅黴素的產率和有效組分的比例。氨水因鹼性較強，因此使用時要防止局部過堿，加強攪拌，並少量多次的加入。另外在氨水中還含有多種嗜鹼性微生物，因此在使用前應用堿石棉等過濾介質進行除菌過濾。這樣可防止因通氨而引起的污染。第一節工業發酵培養基

三、無機鹽及微量元素微生物在生長素和生產過程中，需要某些無機鹽和微量元素如磷、鎂、硫、鉀、鈉、鐵、氯、錳、鋅、鈷等，以作為其生理活性物質的組成或生理活性作用的調節物。這些物質一般在低濃度進對微生物生長和產物合成有促進作用，在高濃度時常表現出明顯的抑制作用。而各種不同微生物及同種微生物在不同的生長階段對這些物質的最適濃度要求均不相同，因此，在生產中要通過試驗預先瞭解菌種對無機鹽和微量元素的最適需求量，以穩定或提高產量。第一節工業發酵培養基在培養基中，鎂、磷、鉀、硫、鈣和氯等常以鹽的形式（如硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、氯化鉀等）加入，而鈷、銅、鐵、錳、鋅、鉬等缺少了對微生物生長固然不利，但因其需要量很少，除了合成培養基外，一般在複合培養基中不再另外單獨加入。因為複合培養基中的許多動、植物原料如花生餅粉、黃豆餅粉、蛋白腖等都含有微量元素。但有些發酵工業中也有單獨加入微量元素的，例如生產維生素B12，儘管用的也是天然複合材料，但因鈷是維生素B12的組成成分，因此其需要量是隨產物量的增加而增加，所以在培養基中就需要加入氯化鈷以補充鈷。第一節工業發酵培養基磷是核酸和蛋白質的必要成分，也是重要的能量傳遞者--三磷酸腺苷的成分；在代謝途徑的調節方面，磷起著很重要的作用，磷有利於糖代謝的進行，因此它能促進微生物的生長，但磷若過量時，許多產物的合成常受到抑制，例如在谷氨酸的合成中，磷濃度過高就會抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，使菌體生長旺盛，而谷氨酸的產量卻很低，代謝向纈氨酸方向轉化。還有許多產品如鏈黴素、土黴素、新生黴素、檸檬酸（表面培養）等都受到磷濃度的影響。第一節工業發酵培養基

據文獻報導，許多次級代謝過程對磷酸鹽濃度的承受限度比生長繁殖過程低，所以必須嚴格控制。但有一些產物要求磷酸鹽濃度的高些。如黑麯黴NRRL330菌種生產α-澱粉酶，若加入0.2%磷酸二氫鉀則活力可比低磷酸鹽提高3倍。還有報導用地衣芽孢桿菌生產α-澱粉酶時，添加超過菌體生長所需要的磷酸鹽濃度，則能顯著增加α-澱粉酶的產量。鈣培養基中鈣鹽過多時，會形成磷酸鈣沉澱，降低了培養基中可溶性磷的含量，因此，當培養基中磷和鈣均要求較高濃度時，可將二者分別消毒或逐步補加。第一節工業發酵培養基鎂除了組成某些細胞的葉綠素的成分外，並不參與任何細胞物質的組成。但它處於離子狀態時，則是許多重要酶（如已糖磷酸化酶，檸檬酸脫氫酶，羧化酶等）的啟動劑，鎂離子不但影響基質的氧化，還影響蛋白質的合成。鎂離子對一些氨基糖苷類抗生素的產生菌有提高菌體對自身所產的抗生素的耐受能力的作用，如卡那黴素、鏈黴素、新生黴素等產生菌。鎂常以硫酸鎂的形式加入培養基中，便在鹼性溶液中會生成氫氧化鎂沉澱，因此配料時要注意。第一節工業發酵培養基硫存在於細胞的蛋白質中，是含硫氨基酸的組成成分和某些輔酶的活性基，如輔酶A，硫鋅酸和穀胱甘肽等。在某些產物（如青黴素、頭孢黴素等）分子中硫是其組成部分。所以在這些產物的生產培養基中，需要加入如硫酸鈉或硫代硫酸鈉等含硫化合物作硫源。鐵它是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的成分，因此鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素。工業生產上一般用鐵制發酵罐，這種發酵罐內的溶液即使不加任何含鐵化合物，其鐵離子濃度已達到30µg/mL另外一些天然培養基的原料中也含有鐵，所以在一般發酵培養基中不再加入含鐵化合物。第一節工業發酵培養基而有些產品對鐵很敏感，如青黴素要求最適鐵含量在20µg/mL以下。又如在檸檬酸生產中，鐵離子的存在會啟動順烏頭酸酶的活力，使檸檬酸進一下代謝為異檸檬酸，這樣不但降低了產率，而且還給提取工段帶來麻煩，據報導在無鐵培養基中產酸率可比含鐵培養基提高近3倍。生產啤酒時，糖化用水若鐵離子濃度高，就會降低酵母的發酵活力，引起啤酒的冷混濁，影響啤酒品質。一般釀造用水鐵離子含量應在0.2～0.5mg/L以下。因此上述產品應使用不銹鋼發酵罐。新發酵罐往往會造成培養基鐵離子濃度過高，所以要加以處理。處理方法採用在罐內壁塗生漆或耐熱環氧樹脂等作保護劑防止鐵離子脫落。第一節工業發酵培養基氯氯離子在一般微生物中不具有營養作用，膽對一些嗜鹽菌來講是需要的。在一些產生含氯代謝物（如金黴素和灰黃黴素等）的發酵中，除了從其他天然原料和水中帶入的氯離子外，還需加入約0.1%氯化鉀以補充氯離子。啤酒在糖化時，氯離子含量在20～60mg/L範圍內，則能賦予啤酒口味柔和，並對酵和酵母的活性有一定的促進作用。但氯離子含量過高會引起酵母早衰，使啤酒帶有鹹味。第一節工業發酵培養基鈉、鉀、鈣鈉、鉀、鈣等離子雖不參與細胞的組成，但仍是微生物發酵培養基的必要成分。鈉離子與維持細胞滲透壓有關，故在培養基中常加入少量鈉鹽，只用量不能過高。否則會影響微生物的生長。鉀離子也與細胞滲透壓和透性有關，並且還是許多酶的啟動劑，它能促進糖代謝。在谷氨酸發酵中，菌體生長時需要鉀離子約0.01%，生產谷氨酸時需要量約為0.02%～0.1%(以K2SO4計)。鈣離子能控制細胞透性，它不能逆轉高濃度無機磷對某些產品如鏈黴素等的抑制作用。第一節工業發酵培養基常用的碳酸鈣本身不溶於水，幾乎是中性，但它能與代謝過程中的pH有一定的調節作用。在配製培養基時要注意，先要將配好的培養基用堿調到到PH近中性，才能將CaCO3加入培養基中,這樣可以防止CaCO3在酸性培養基中被分解,而失去其在發酵過程中的緩衝能力,所採用的要CaCO3要對其中CaO等雜質含量作嚴格控制.鋅、鈷、錳、銅鋅、鈷、錳、銅等微量元素大部分作為酶的輔基和啟動劑，一般來講只有在合成培養基中才需加入這些元素。第一節工業發酵培養基四、前體物質和促進劑發酵培養基中某些成分的加入有助於調節產物的形成，而並不促進微生物的生長，這些添加的物質包括前體、抑制劑和促進劑（包括誘導劑、生長因數等）。1．前體物質指某些化合物加入到發酵培養基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產物分子中去，而其自身的結構並沒有多大的變化，但是產物的產量卻因加入前體面有較大的提高。前體最早是從青黴素的生產中發現的。第一節工業發酵培養基在青黴素生產中，人們發現加入玉米漿後青黴素單位可從20µg/mL增加到100µg/mL，進一步研究後發現單位增長的主要原因是玉米漿中含有苯乙胺，它被優先結合到青黴素分子中去，從而提高了青黴素G的產量，大大提高了苄青黴素在培養液中所占的比例。一些重要的前體例子見表3-3。有些物質，例如苯乙酸，丙酸等濃度過高時對菌體會產生毒性。此外菌體還具有將前體氧化分解的能力，因此在生產中為了減少毒性和提高前體的利用率，常採用少量多次地加入前體。總的加入量可按每一個產物分子中，進入幾個前體分子，按等摩爾計算前體的加入量，在總加入量還應考慮菌體氧化分解的那一部分前體。第一節工業發酵培養基例計算紅黴素發酵單位為4000µg/mL時，需要加入多少丙酸前體。解紅黴素的大環內脂有21個碳，由7個3碳化合物組成，所以紅黴素與丙酸的的摩爾比為1：7（紅黴素分子量為733，丙酸分子量為74），4000µg/mL紅黴素，相當於每長升培養液中有4g紅黴素，所以7*74/733=x/4加入丙酸量x=7*74*4/733=2.83g/L=0.28%考慮到菌體對丙酸的氧化率約為50%，所以生產上約加入0.6%的丙酸。分4-5次加入培養液中。第一節工業發酵培養基表3-3發酵產品中常用的前體產品前體產品前體青黴素G青黴素V金黴素

鏈黴素紅黴素苯乙酸及有關衍生物苯氧乙酸氯化物

肌醇、精氨酸丙酸、丙醇、丙酸鹽維生素B12胡蘿蔔素L-異亮氨酸

L-色氨酸L-絲氨酸鈷化物β-紫羅蘭酮α-氨基丁酸D-蘇氨酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸第一節工業發酵培養基在發酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產物或使正常代謝的某一代謝中間物質積累起來。最早的例子是用微生物發酵生產甘油。在生產甘油的發酵液中加入亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中產生的乙醛生成加成物。反應式如下：CH3CHO+NaHSO3→CH3CH(OH)OSO3Na第一節工業發酵培養基這樣使乙醇代謝途徑中的乙醛不能成為NADH2（還原型輔酶Ⅰ）的受氫體，而使NADH2在細胞中積累，從而啟動α-磷酸甘油脫氫酶的活性，使磷酸二羥基丙酮取代乙醛作NADH2的受氫體而還原為α-磷酸甘油，其水解後即形成甘油。除亞硫酸氫鈉外，亞硫酸鈉也是乙醇代謝的抑制劑。它們都是能促進甘油的生物合成。在四環素的生產中，加入溴化劑（NaBr）能抑制金黴素形成的代謝途徑，促進四環素的生成。第一節工業發酵培養基

2．發酵過程中的促進劑和抑制劑促進劑指那些既不是營養物理又不是前體，但卻能提高產量的添加劑。例如加巴比妥鹽能使利福黴素毒素單位增加，並能使鏈黴菌素推遲自溶，延長分泌期；加酵母甘露聚糖可誘導α-甘露糖甘酶的產生，促使甘露糖鏈黴素轉化為鏈黴素；控制生物素的加入量，可以促進谷氨酸從細胞內分泌到細胞外，加聚乙烯槨衍生物可防止菌絲結球，提高糖化酶的產量等。近年來在培養基中加入表面活性劑的報導也較多，尤其是在底物和產物均為不溶或微溶於水的發酵中，表面活性劑有增加滲透性，促使固體物分散從而強化傳質和傳氧的作用。第二節培養基的類型及選擇

一、培養基的類型培養基按基組成物質的純度、狀態、用途可分為三大類型：

1．按純度按培養基組成物質的純度可分為合成培養基和天然培養基（複合培養基）。前者所用的原料其化學成分明確、穩定。例如藥用葡萄糖、（NH4）2SO4、KH2PO4等，這種培養基適合於研究菌種基本代謝和過程的物質變化等科研工作，在生產某些疫苗的過程中，為了防止異性蛋白等雜質混入，也常用合成培養基。但這種培養基營養單一，價格較高。不適合用天大規模工業生產。第二節培養基的類型及選擇發酵工業普遍使用天然培養基。它的原料是一些天然動植物產品，相對於合成培養基來講，其成分不是那麼“純”。例如花生餅粉、蛋白腖等。這些物質的特點是營養豐富，適合於微生物的生長。一般天然培養基中不需要另加微量元素、維生素等物質，而培養基組成的原料來源豐富（大多為農副產品）、價格低廉，適用於工業生產。但由於組分複雜，不易重複，如對原料品質等方面不加控制會影響生產的穩定性。第二節培養基的類型及選擇

2．按培養基物理物理性狀分類按培養基的狀態，可分為固體培養基、半固體培養基和液體培養基。固體培養基比較適合於菌種和孢子的培養和保存，也廣泛應用於有子實體的真菌類。如香茹、白木耳等的生產。近年來由於機械化程度的提高，在發酵工業上又開始應用固體培養基進行大規模的生產。其組分常用麩皮、大米、小米、木屑、禾殼和瓊脂等，有的還另加一些其他營養成分。半固體培養基即在配好的液體培養基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%，培養基即呈半固體狀態，主要用於鑒定菌種，觀察細菌運動牲及噬菌體的效價滴定等。液體培養基80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養成分，是發酵工業大規模使用的培養基，它有利於氧和物質的傳遞。第二節培養基的類型及選擇

3．按培養基的用途分類培養基按其用途可分為孢子培養基、種子培養基和發酵培養基三種。（1）孢子培養基孢子培養基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養基，對這種培養基的要求是通使菌體迅速生長，產生較多優質的孢子，並要求這種培養基不是易引起菌種發生變異。所以對孢子培養基的基本配製要求是：第一，營養不要太豐富（特別是有機氮源），否則不易產孢子。如灰色鏈黴菌在葡萄糖-硝酸鹽-其他鹽類的培養基上都能很好地生長和產孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白後，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃度在適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養基的pH和濕度。第二節培養基的類型及選擇生產上常用的孢子培養基有：麩皮培養基、大米培養基、玉米碎屑培養基和用葡萄糖、蛋白腖、牛肉膏和食鹽等配製成的瓊脂斜面培養基。大米和小米常用作黴菌孢子培養基，因為它們含氮量少，疏鬆、表面積大，所以是較好孢子培養基。大米培養基的水分需控制在21%～25%較為適宜。在酒精生產中，當制曲（固體培養）時，曲料水分含量需控制在48%～50%，而曲房空氣濕度需控制在90%～100%。第二節培養基的類型及選擇（2）種子培養基種子培養基是供孢子發芽、生長和大量繁殖菌絲體，並使菌體長得粗壯，成為活力強的“種子”。所以種培養基的營養成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種子培養基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩定的pH，其組成還要根據不同菌種的生理特徵而定。一般種子培養基都用營養豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發芽。但無機氮源容易利用，有利於菌體迅速生長，所以種子培養基中常包括有機及無機氮源。最後一級種子培養基的成分最好能較接近發酵培養基，這樣可使種子進入發酵培養基後能迅速適應，快速生長。第二節培養基的類型及選擇（3）發酵培養基發酵培養基是供菌種生長、繁殖和合成產物之用。它既要使種子接種後能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成所需產物。因此，發酵培養基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養基用分批補料來加以滿足。第二節培養基的類型及選擇

二、培養基成分和配比的選擇培養基的組分（包括這些組分的來源和加工方法）、配比、緩衝能力，粘度，消毒是否易徹底，消毒後營養破壞程度，及原料中雜質的含量都對菌體生長和產物形成有影響。但目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養基配方。目前還只能在生物化學、細胞生物學等的基本理論指導下，參照前人所使用的較適合於某一類菌種的經驗配方，再結合所用菌種和產品的特性，採用搖瓶、玻璃罐等小型發酵設備，對碳源、氮源、無機鹽和前體等進行逐個單因數試驗，觀察這些因數對菌體生長和產物合成量的影響。第二節培養基的類型及選擇

最後再綜合考慮各因素的影響，得到一個比較適合本菌種的生產配方，以求得到高產。為了加快試驗時間，可考慮用“正交試驗設計”等數學方法來確定培養基組分和濃度，它可以通過比較少的實驗次數而得到比較滿意的結果。另外還可通過方差分析，瞭解那個因素影響較大，以引起人們的注意。在考慮培養基總體要求時，要注意一些問題。第一，考慮碳源、氮源時，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，發揮各自的優勢，避其所短。第二節培養基的類型及選擇第二，選用適當的碳氮比。培養基中碳氮比的影響極為明顯。氮源過多，會使菌體生長過於旺盛，pH偏高，不利於代謝產物的積極，氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產量，碳源過多，則容易形成較低的pH，若碳源不足，易引起菌體衰老自溶。另外碳氮比不當還會影響菌體按比例地吸收營養物質，直接影響菌體的生長和產物的形成。菌體在不同的生長階段，其對碳氮比的最適要求也不一樣。一般碳源因為既作碳架又作能源，因此用量要比氮多。從元素分析來看，酵母菌細胞中碳氮比約為100：20；黴菌約為100：10；一般工業發酵培養基的碳氮比就要相對高一些。例如谷氨酸生產中取碳氮比100：15～21，若碳氮比為100：0.5～2.0，則會出現只長菌體，而幾乎不合成谷氨酸的現象。碳氮比隨碳水化合物及氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異，很難確定一個統一的比值。第二節培養基的類型及選擇第三，要注意生理酸、鹼性鹽和pH的變化情況，以及最適pH的控制範圍等，綜合考慮選用什麼生理酸鹼性物質及用量，從而保證在整個發酵過程中pH都能維持在最佳狀態（有時也可考慮用中間補料來控制pH）培養基成分的用量的多少，大部分是根據經驗而來。但有些主要代謝的產物因為它們的代謝途徑比較清楚，所以可以根據物料平衡計算來加以確定，例如在酒精生產中可根據澱粉的用量計算酒精的理論產率。第二節培養基的類型及選擇

酒精的轉化式：

所以100kg澱粉理論上可以產酒精為：162：2*46=100：x酒精x=2*46*100/162=56.78kg對次級代謝產物來講，因為對生物合成途徑的瞭解有限，因此要用化學計量關係來計算培養基楊分的得率是比較困難的。但也有人根據物料及能量平衡計算了碳源轉化為青黴素的得率。第二節培養基的類型及選擇

Cooney(1979)根據化學反應計量關係和經驗數據得出下式：

從上式可計算出青黴素G的理論得率為每克葡萄糖得1.1克青黴素G。在確定培養基中碳源數量時，還要考慮用於菌體生長和維持所需消耗。在選擇培養基所用的有機氮源時，特別要注意原料的來源、加工方法和有效成分的含量。有機氮源大部分為農副產品，其中所含的成分受產地、加工、貯藏等的影響較大，常會引起產量的波支。例如黃豆餅粉、花生餅粉、棉子餅粉等，它們的產地不同有機氮的成分和含量也不同，東北大豆含胱氨酸和蛋氨酸的量比華北、江南產的黃豆含量高，有利於鏈黴素的生產。第二節培養基的類型及選擇又如豆餅粉加工有熱榨和冷榨兩種，它們對發酵產品的產量影響就各不相同。在醬油生產中採用熱榨豆餅較好，因為熱榨豆餅中水分含量少，蛋白質含量高，易破碎且使用方便。而鏈黴素生產卻以冷榨豆餅為宜。兩種處理方法的豆餅其所含的成分見表3-4。低溫貯藏可延長貯存期，若於室溫存放，尤其是夏天，豆餅中的油脂等易氧化變質，影響微生物的生物合成。發黴變質的餅粉對產量也有明顯影響。國外為了穩定生產，把棉籽餅粉加工製成得成分穩定的商品藥用培養基，已用於青黴素等發酵生產。第二節培養基的類型及選擇表3-4熱榨豆餅和冷榨豆餅的主要成分含量成分加工方法水分（%）粗蛋白（%）粗脂肪（%）碳水化合物（%）灰分（%）冷榨熱榨12．123．3846．4547．946．123．7426．6422．845．446．31第二節培養基的類型及選擇

糖蜜是制糖工業的副產物，其工藝有碳酸法和亞硫酸法，這兩種工藝所得糖蜜的成分有所沒同，見表3-5。即使同種工藝不同產地的甘蔗（土質、氣候）和存放期不同都影響糖蜜的品質，所以它的有效成分波動甚大。用甜菜製作的糖蜜，轉化糖含量低，pH呈鹼性。甘蔗糖蜜轉化糖含量高，pH呈酸性。還有些發酵廠用葡萄糖結晶後得的母液作碳源。在製備培養基時水質的影響也應注意，各地區的深井水和自來水的品質有很大差別。其中微量元素的含量，對成分簡單的孢子培養基有較大的影響。在制酒或啤酒工業中更要注意選擇水源、控制水的硬度、含鐵量、含氯量及氨態、硝酸態和亞硝酸態氮的含量，一般常用電滲析或離子交換樹脂等進行水的純化。第二節培養基的類型及選擇

培養基的原料在大規模工業生產中用量很大。在選用時，應儘量選用豐富的廉價原料，設法降低成本。例如原來生產賴氨酸用山芋澱粉，後來改用山芋粉為碳源，這樣不僅價廉，而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等，當培養基改用山芋粉後，就將可省去原來要加的玉米漿，硫酸鎂，並使整個成本降低15%。有些原料在使用前要進行預處理。如一些穀物或山芋幹等農產品，使用前要去除雜草、泥塊、石頭、小鐵釘等雜物以免損壞粉碎機。又如在酒精、丙酮、丁醇等的生產中，澱粉原料使用量大，需要預先進行蒸煮、糊化，使酵母能有效的將其糖化。糊化過程度與溫度、時間有關，蒸煮溫度過低使糊化不充分，影響糖化率；反之，則會發生焦化等情況，影響營養成分，甚至產生黑色素等有害物質。第二節培養基的類型及選擇

為了避免長時間的蒸煮，可將大塊幹薯加以粉碎過篩。國外生產抗生素用培養基均通過200目篩子。有些穀物如大麥、高梁、橡子等原料最好先去皮殼，這樣一方面可防止皮殼中有害物和單寧等有帶入發酵醪（液），影響微生物生長和產物形成；另一方面大量皮殼占去一定體積，降低了設備的利用率，且易堵塞管道，增加流動阻力。在使用糖蜜時，在必要時，也要進行預處理。例如在檸檬酸生產時，為了去除糖蜜中鐵離子，防止異檸檬酸的產生，要預先加入黃血鹽去除鐵離子。在酒精生產或酵母生產中若使用糖蜜，則需要預先進行稀釋、酸化、滅菌、澄清和添加營養鹽等處理。因為糖蜜中幹物質濃度很大，糖份高、產酸細菌多，灰份和膠體物質也很多，酵母無法生長。第二節培養基的類型及選擇

表3-5甘蔗糖蜜的成分專案產地及加工方法比重蔗糖（%）轉化糖（%）全糖（%）灰分（%）蛋白質（%）廣東（亞硫酸法）廣東（碳酸法）四川（碳酸法）

0．

491．4033．0027．0035．8018．0820．0019．0051．9847．0054．8013．2012．0011．10/0．

900．54第三節培養基的配製

一、培養基的配製原則培養基的必須提供合成微生物細胞和發酵產物的基本成分；有利於減少培養基原料的單耗，單位營養物質所合成產物數量大或產率大；有利於提高培養基產物的濃度，以提高單位窖發酵罐的生產能力；有利於提高產物的合成速度，縮短發酵週期；儘量減少副產物的形成；減少對發酵過程中通氣攪拌的影響，有利於提高氧的利用率、降低能耗；有利於產品的分離和純化；並盡可能減少產生“三廢”的物質。第三節培養基的配製當然設計任何一種培養基者不可能面面俱到地滿足上述各項要求，需根據具體情況，抓主要環節。使其即滿足微生物的營養要求，又能獲得優質高產的產品，同時也符合增產節約，因地制宜的原則，發酵培養基的主要作用是為了獲得預期的產物，因此根據產物特點來設計培養基。因此要求營養要適當豐富和完備，菌體迅速生長和健壯，整個代謝過程pH值適當且穩定；糖、氮代謝能完全符合高單位罐、批的要求、能充分發揮生產菌種合成代謝產物的能力。第三節培養基的配製

1．根據微生物的培養需要不同的微生物所需要的培養基成分是不同的，要確定一個合適的培養基，就需要瞭解生產用菌種的來源、生理生化特性和一般的營養要求，根據不同生產菌種的培養條件、生物合成的代謝途徑、代謝產物的化學性質等確定培養基。

第三節培養基的配製2．營養成分比例恰當微生物所需的營養物質之間應有適當的比例，培養基中的碳氮的比例（C/N）在發酵工業中尤其重要。如培養基中氮肥源過多，會引起微生物生長過於旺盛，而不利於產物的積累；氮源不足，則微生物菌體生長過於緩慢。當培養基中的碳源供應不足時，容易引起微生物菌體的衰老和自溶。培養基的碳氮比不僅會影響微生物菌體的生長，同時也會影響到發酵的代謝途徑。不同的微生物菌種、不同的發酵產物所要求的碳氮比是不同的。即使是同一微生物在不同的培養階段，對培養基的碳氮比的要求也是不一樣的。第三節培養基的配製

3．滲透壓配製培養基時，應注意營養物質要有合適的濃度。營養物質的濃度太低，不僅不能滿足微生物生長對營養物質的需求，而且也不利於提高發酵產物的產量和提高設備的利用率。但是，培養基中營養物質的濃度過高時，由於培養基的滲透壓太大，會抑制微生物的生長。此外培養基中的各種離子的濃度比例也會影響到培養基的滲透壓和微生物的代謝活動，因此，培養基中各種離子的比例需求要平衡。在發酵生產過程中，在不影響微生物的生理特性和代謝轉化率的情況下，通常趨向在較高濃度下進行發酵，以提高產物產量，並盡可能選育高滲透壓的生產菌珠。當然，培養基濃度太大會使培養基黏度增加和溶氧量降低。第三節培養基的配製4．pH值各種微生物的正常生長需要有合適的pH值，一般黴菌和酵母菌比較適於微酸性環境，放線菌和細菌適於各種中性或鹼性環境。為此，當培養基配製好後，若pH值不合適，必須加以調節。當微生物在培養過程中改變培養基的pH值而不利於本身的生長時，應以微生物菌體對各種營養成分的利用速度來考慮培養基的組成，同時加入緩衝劑，以調節培養液的pH值。第三節培養基的配製

5．氧化還原電位對大多數微生物來說，培養基的氧化還還原電位一般對其生長的影響不大，即適合它們生長的氧化還原電位範圍較廣。但對於厭氧菌，由於氧的存在對其有毒害作用，因而往往在培養基中加入還原劑以降低氧化還原電位。在配製培養基時，除應注意以上幾條原則外，還要考慮到營養成分的加入順序，為了避免生成沉澱而造成營養成分的損失，加入順序一般為先加入緩衝化合物，溶解後加入主要物質，然後加入維生素，氨基酸等生長素類物質。第三節培養基的配製

二、培養基成分配比的選擇培養基的組分（包括這些組分的來源和加入方法）、配比、緩衝能力、黏度、消毒是否徹底、消毒後營養破壞的程度及原料中雜質的含量都對菌體生長和產物形成有影響。目前還只能在生物化學、細胞生物學等的基本理論指導下，參照前人所使用的較適合於某一類菌種培養基的經驗配方，再結合所用菌種的產品的特性，採用搖瓶、玻璃瓶等小型發酵設備，對碳、氮無機鹽和前體等進行逐個單因數試驗，觀察這些因數對菌體生長和產物合成量的影響，最後再綜合考慮各因素的影響，得到一個適合該菌種的培養基的配方，以得到高產。第三節培養基的配製為了減少實驗次數，可考慮用“正交試驗設計”等數學方法來確定培養基給分和濃度，它可以通過比較少的實驗次數而得到較滿意的結果，另處，還可通過方差分析，確定哪些因素影響較大，以引起人們的注意。需要注意的是考慮碳源、氮源時，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，發揮各自優勢，避其所短，選用適當的碳氮比。氮源過多，則菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利於代謝產物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產量。碳源過多，則容易形成較低的pH值；碳源不足，菌體衰老和自溶。第三節培養基的配製另外碳氮比不當還會影響菌體按比例地吸收營養物質，直接影響菌體和產物的形成。菌體在不同生長階段，對其碳氮比的最適要求也不一樣。由於碳既能做碳架又作能源，所以用量要比氮多。從元素分析來看，酵母細胞中碳氮比約為100：20，黴菌約為100：10。一般發酵工業中碳氮比約為100：（0.2～2.0）。但在氨基酸發酵中，因為產物中含有氮，所以碳氮比就相對高一些。如谷氨酸發酵的C：N=100：（15～21），若碳氮比為100：（0.2～2.0），則會出現只長菌體，幾乎不產谷氨酸的現象。

第三節培養基的配製

C/N隨碳水化合物及氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異，很難確定統一的比值。另外還要注意生理酸、鹼性鹽和PH緩衝劑的加入和搭配，根據該菌種在現有工藝設備的條件下，其生長和合成產物時pH值的變化情況，以及最適pH值所控制範圍內，綜合考慮選用什麼生理酸、鹼性物質及用量，從而保證整個發酵過程中pH值都能維持在最佳狀態。有時考慮用中間補料來控制pH值。培養基各成分用量的多少，大部分是根據經驗面來。但有些主要代謝產物因為它們的代謝途徑較清楚，所以根據平衡計算來加以確定。第三節培養基的配製在確定培養基中碳源數量時，要考慮用菌體生長和維持所需的消耗。在考慮培養基所用的有機氮源時，特別注意原料的來源、加入方法和有效成分的含量。製備培養基時，也應該考慮水分。培養基在大規模生產中用量很大，在選用時應儘量地利用較豐富的廉價原料，設法降低成本。例如，賴氨酸（Lys）生產中用山芋澱粉，後改為用山芋粉為碳源，這樣不僅價廉而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等，省去了原來所加的玉米漿、硫酸鎂，並使整個成本降低15%。第三節培養基的配製

三、配置培養基的基本過程配置培養基的基本流程如下：

原料稱量--溶解--調節pH值--過濾澄清--分裝--塞棉塞和包紮--滅菌

1.原料稱量、溶解根據培養基配方，準確稱取各種原料成分，在容器（常採用鋁鍋或不銹鋼鍋）中先加所需水量的一半，然後依次將各種原料加入水中，用玻璃棒攪拌使之融化，某些不易溶解的原料如蛋白腖、牛肉膏等可事先在小容器中加水少許並加熱溶解後再沖入容器中，有些原料需用量很小，不易稱量，可先配成高濃度的溶液，在按比例換算後取一定體積的溶液加入容器中。待原料全部放入容器後，加熱使其充分溶解，最後補足需要的全部水量，即成液體培養基。然後調節至所需的pH值。第三節培養基的配製配置固體培養基時，預先將瓊脂稱好洗淨（粉狀瓊脂除外，條狀瓊脂用剪刀剪成小段，以便融化），然後將液體培養基煮沸，再將瓊脂放入，繼續加熱至瓊脂完全融化。在加熱過程中應注意不斷攪拌，以防瓊脂沉澱糊底燒焦，並應控制火力，以免培養基因暴沸而溢出容器。待瓊脂完全融化後，再用熱水補足因蒸發而損失的水分。

2.酸鹼度（pH值）的調整液體培養基配好後，一般要調節至所需的pH值，常用鹽酸及氫氧化鈉溶液進行調節。第三節培養基的配製調節培養基酸度的最簡單方法是用精密pH試紙進行測定，用玻璃占一滴培養基，點在試紙上進行比色後，如pH值偏酸，則加1%氫氧化鈉溶液，偏堿則加1%鹽酸溶液，經反復幾次調節後，即可基本調至所需pH值，此法簡便易行，但畢竟較為粗放，難於精確。較為準確調節培養基pH值，可用pH計測定。配置大量培養基時，可根據具體情況，如使用1%NaOH溶液（或1%HCI溶液）對試樣調整後，再改用10%NaOH溶液（或10%HCI）對大量培養基進行調整，則較簡便。第三節培養基的配製例如：配置某液體培養基5000ml，經測定pH值為6.4，而要求PH值為7.2，在調整時，可先取5ml培養基於試管中，用1%NaOH溶液調整，記錄堿液用量，再取5ml培養基於另一試管中，再調一次，記錄堿液用量。設經二次調整得知在5ml培養基中需加入1%NaOH溶液0.1ml（兩次平均值）即可調整pH值為7.2，則可按下式進行換算，得出10%NaOH溶液調整剩餘大量培養基時所需的總量。使用高濃度的堿液或酸液進行培養基PH值調整，可避免由於使用低濃度溶液調整時因使用量過多而影響培養基的總體積和濃度，並可節約工作時間。第三節培養基的配製

固體培養基酸鹼度的調整，與液體培養基通，一般在加入瓊脂前進行，加入瓊脂後如需在進行調整時，應注意將培養基溫度保持在60攝氏度以上，以防因瓊脂凝固影響工作進行。3.培養基的過濾和澄清培養基配成後，往往因其中含有某些未溶解的物質而混濁或不透明，應在分裝前過濾，除去沉渣、顆粒，使之澄清透明，特別是用於觀察微生物的培養特徵及生長情況、生理生化特性以及用於平板計數的固體培養基，都要求使用透明度高的培養基。第三節培養基的配製

培養基過濾和澄清的方法，有以下幾種：(1)紗布過濾：用3～4層紗布（醫用敷料紗布）或1～2層粗平紋白布兜起來，直接傾倒過濾，或把布鋪在漏斗上傾倒過濾，這種方法只濾去較粗渣滓，不能使培養基透明。(2)棉花過濾：用一小塊脫脂棉塞在漏斗管的上口，使不致浮起也不要塞得過緊，先用少量清水浸濕後，再傾倒培養基過濾。開始時，棉花空隙大，過濾速度快但透明度差，待濾渣逐漸填充棉花空隙後，即形成棕濾層，此時濾速漸慢但透明度越來越好，如不換棉花，而把培養基重複過濾一次，可得到較透明的培養基。第三節培養基的配製

（3）保溫過濾：加有瓊脂的培養基，不論用紗布或棉花過濾，都應在保持600C以上的情況下進行，否則易造成瓊脂凝固而不能過濾。一般可用預先加溫的辦法，即將瓊脂培養基盛在鍋裏，並置火上保溫，乘熱過濾。但在天冷過濾時，有時稍有停頓，瓊脂就會凝固在漏斗裏的紗布或棉花上。為了保證瓊脂培養基過濾順利，最好使用保溫漏斗，它地用白鐵皮或銅板焊制而成的夾套，由上面的注入孔裝入熱水，用酒精燈在加熱筒的下麵加熱保溫。這種保溫過濾裝置特別適用於瓊脂培養基過濾後的分裝（如分裝試管制做的斜面），因為分裝拖延時間長，如不保溫，最易凝固。第三節培養基的配製

4.培養基的分裝培養基配好後，要根據不同的使用目的，分裝到各種不同的容器中，用於不同於途的培養基，其分裝量應視具體情況而定，要做到適量，實用。分裝量過多過少、使用容器不當，都會影響以後的工作品質。培養基都不得是各種營養物質的混合液，且大多具有黏性，再分裝過程中，應注意勿使培養基沾汙管口和瓶口，以免弄濕或粘住棉塞造成污染。第三節培養基的配製

分裝培養基，通常使用一個大漏斗（小容量分裝）或底部有出口的鐵筒（大容量分裝），吊在漏斗架上或牆上，下口連接一段軟橡皮管，橡皮管下麵在連接一段末端開口處略細的玻璃管，在橡皮管上夾一個手控彈簧夾，分裝時，將玻璃嘴插入試管內，不要觸及管壁，捏開彈簧夾，注入定量培養基後，先止住液體，再抽出玻璃管，仍不要觸及管壁或管口。如果大量成批定量分裝，可用定量送樣器，即將培養基盛入1000ml獲500ml定量送樣器中，調好所需體積，然後通過抽提、壓送，即可分裝到試管中，注意抽出試管時，勿使培養基沾汙管口。此外，也應注意勿使漏斗下端及管口或瓶口。第三節培養基的配製

培養基中如有某些不溶於水的原料（如碳酸鈣），應在分裝前不斷攪拌，使成懸浮狀態，才能均勻的分裝到各容器內。培養基的分裝量，必須依照使用目的及試驗的具體情況決定。

5.塞棉塞和包紮培養基分裝到各種規格的容器（如試管、三角瓶、克氏瓶等）後，應按管口或瓶口的不同大小分別塞以大小適度、鬆緊適合的棉塞。加棉塞的作用主要在於阻止外界微生物進入培養基內，防止由此可能導致的污染，同時還可保證良好的通氣性能，使微生物能不斷的花獲得無菌空氣。第三節培養基的配製

塞棉塞後，管裝培養基可每七支紮成一捆，或排放在鐵絲筐內，由於棉塞外面容易附著灰塵及雜菌，且滅菌時容易凝結水氣，因此在滅菌前和存放過程中，應用牛皮紙或廢報紙將管口、瓶口或成捆成筐的培養基罩起來，再用橡皮圈或線繩紮緊。

6.培養基滅菌一般情況下，經分裝、塞棉塞、包紮後，應立即進行滅菌（滅菌法見後）。如延誤時間，則因雜菌繁殖孽生，可能導致培養基變質而不能使用，特別在夏季炎熱天氣，如不及時滅菌，數小時內培養基就可能變質。若確實不能立即滅菌，可將培養基暫放4攝氏度冰箱或冰櫃中，但時間不宜過久。第三節培養基的配製

滅菌後，需做斜面的試管，應趁熱及時擺成斜面，斜面也可在特製的斜面架上擺放，斜面的斜度要適當，使斜面的長度約為管長的1/3。擺放時注意不可使培養基沾汙棉塞，冷凝過程中勿在移動試管，待斜面完全凝固後，在進行收放。滅菌後的培養，應保溫培養2～3天，檢查滅菌效果，然後使用，數量太大時，可抽樣檢查，如發現問題，應再次滅菌，以保證使用前的培養基處於絕對無菌狀態。第三節培養基的配製

7.培養基的貯存概言之，培養基不宜配製過多。最好是現配現用，因培養基較長時間擱置不用或貯存不當，則往往因污染、脫水或光照等因素而變質。因工作需要或一時用不掉的培養基應放在低溫、低濕、陰暗而潔淨的地方保存。試管斜面培養基，因滅菌時棉塞受潮，容易引起污染。因此，新配製的瓊脂斜面最好置恒溫室數天待棉塞上的冷凝水蒸發後再貯存備用。裝於三角瓶或其他容器的培養基，滅菌前最好用牛皮紙包紮瓶口，以防灰塵落於棉塞或瓶口而引起污染，貯放過程中，不要取下，以減少水分蒸發。對含有染料或其他對光敏感物質的培養基，要特別注意避光保存，特別是要避免陽光的長時間直接照射。第三節培養基的配製

四、固體曲料的配製在微生物生產特別是微生物工業生產中，常採用一些來源廣泛，價格低廉的固體曲料，如小米、大米、麩皮、豆餅、玉米粉、米糠等來培養黴菌。這些物質中含在一定的碳源和氮源以及生長素和微量元素，而且這類物質具有質地疏鬆透氣，表面積大，因此用來配製孢子培養基定較理想的，釀造及發酵工業上，常用此等原料培養種曲得到大量孢子後用來制曲，此種直接用固體原料加水拌成的固體培養基叫做曲料。第三節培養基的配製

1.曲料的組成原料配製曲料的原料應視具體培養需要而定，但各種曲料基本上都可分為兩部分：一部分是供給營養成分的物質，如豆餅粉、麩皮等；另一部分是造成通氣條件的物質，如穀糠、鋸末等。選用這些材料，可以因地制宜，就地取料，儘量利用農副產品，各種代用品以節約糧食，降低成本。為擴大微生物與營養料的接觸面積，最大限度的發揮營養的作用，曲料的原料應經過粉碎、過篩，達到一定的細度。第三節培養基的配製

通常有兩種單位來表示細度：一是以篩孔直徑（圓孔）或邊長（方孔）的毫米數表示，如0.1mm篩、0.5mm篩、1mm篩等；另一種是以“目”來表示，即在25.4mm（1英寸）長度內排有若干篩孔數值數，如100目個篩孔的一邊總長25.4mm（1英寸），50目即50個篩孔的一邊總長為25.4mm（1英寸）等，其餘類推。用作固體曲料的原料，應該選用優質而新鮮的，發黴變質嚴重的原料，即是在滅菌後雜菌不在滋長，但由於其中營養價值已經耗損殆盡，且因雜菌造成的黴變，往往產生制毒物質，對培養菌有抑制作用，而不能選用。經處理的原料，按比例稱好後，應在潔淨的拌料臺或潔淨容器裏充分混合，使成均勻的混合物。第三節培養基的配製

2.曲料的加水量曲料的加水量的多少，應該視原料的質地、細度即其持水性而定，此外，也應考慮培養菌的特性（需氧性或兼性需氧性等），培養條件（溫度、濕度）等方面因素。一般情況下，可掌握加水量在1：1～1：1.5倍於原料重量。檢驗標誌是：加水後用手攥起來，稍用力擠握，指縫間有水珠溢出而不滴下為度。第三節培養基的配製

3.曲料酸鹼度的調整測定曲料酸鹼度，可用加水後擠出來的溶液測試，或者取一小塊加水後的曲料，放在pH值試紙上，有濕潤部分的顏色判斷其pH值。如在加水拌料時，調整pH值，可將需用堿液容量算入加水量裏，一併加入；如在加水後，再進行調整，就要注意在加入堿溶液後一定要攪拌均勻，以防調整時，局部誤作整體的誤差。第四節澱粉水解糖的製備澱粉是由葡萄糖組成的生物分子，大多數微生物都不能直接利用澱粉，如氨基酸的生產菌、酒精酵母等。因此，在氨基酸、抗生素、有機酸、有機溶劑等的生產中，都要求將澱粉進行糖化，製成澱粉水解糖使用。不管是澱粉水解糖中的葡萄糖或是糖蜜中的蔗糖，它們都是菌體發酵最基本的碳源以及菌體生長和繁殖的能量及碳素來源，也是組成產物分子培養結構的碳架成分。在工業生產中，將澱粉水解為葡萄糖的過程稱為澱粉的糖化，制得的溶液叫澱粉水解糖。在澱粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外，根據水解條件的不同，尚有數量不等的少量麥芽糖及其他一些二糖、低聚糖等複合糖類。第四節澱粉水解糖的製備能夠作為谷氨酸發酵工業原料的水解糖液，必須具備以下條件：①糖液中還原糖的含量要達到發酵用糖濃度的要求。②糖液潔淨，是杏黃色或黃綠色，有一定的透光度。水解糖液的透光度在一定程度上反映了糖液品質的高低。透光度低，常常是由於澱粉水解過程中發生的葡萄糖複合反應程度高，產生的色素等雜質多，或者由於糖液中的脫色條件控制不當所致。③糖液中不含糊精。糊精並不能被谷氨酸利用，它的存在使發酵過程泡沫增多，易於逃料，發酵難以控制，也容易引起雜菌污染。第四節澱粉水解糖的製備④糖液不能變質。這就要求水解糖液的放置時間不宜太長，以免長菌、發酵而降低糖液的營養楊分或產生其他的抑制物，一般現做現用。目前，由澱粉經水解製備葡萄糖（或葡萄糖液）除了應用於氨基酸發酵外，制藥工業（如抗菌素類的發酵），在葡萄糖的生產中也普遍使用，而且也發展成為一門獨立的工業--葡萄糖工業。一、澱粉水解糖的製備方法可以用來製備澱粉水解糖的原料很多，主要有薯類、玉米、小麥、大米等含澱粉原料。根據原料澱粉的性質及採用的水解催化劑的不同，水解澱粉為葡萄糖的方法有下列三種。第四節澱粉水解糖的製備

1．酸解法（acidhydrdlysismethod）酸解法又稱酸糖法。這是以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將澱粉水解轉化為葡萄糖的方法。用酸解法生產葡萄糖，具有生產方便、設備要求簡單、水解時間短、設備生產能力大等優點。但由於水解作用是在高溫、高壓及一定酸度條件下進行的，因此，酸度法要求有耐腐蝕、耐高溫、耐高壓的設備。此外，澱粉在酸水解過程中所發生的化學變化是很複雜的，除了澱粉的水解反應外，尚有副反應的發生，這將造成葡萄糖的損失而使澱粉的轉化率降低。酸水解法對澱粉原料要求較嚴格，澱粉顆粒不宜過大，大小要均勻。顆粒大，易造成水解不透徹；澱粉乳濃度也不宜過高，濃度高，澱粉轉化率低，這些是酸解法存在的待解決的問題。第四節澱粉水解糖的製備

2．酶解法酶解法是用專一性很強的澱粉酶及糖化酶將澱粉水解為葡萄糖的工藝。利用α-澱粉酶將澱粉液化轉化為糊精及低聚糖，使澱粉的可溶性增加，這個過程稱為液化。利用糖化酶將糊精及低聚糖進一步水解為葡萄糖，這個過程在生產中稱為糖化。澱粉的液化和糖化都是在酶的作用下進行的，故酶解法又有雙酶（或多酶）水解法之稱，優點如下。（1）採用本法製備葡萄糖，酶解反應條件較溫和。因此，不需耐高溫、高壓、耐酸的設備，便於就地取材，容易運作。第四節澱粉水解糖的製備

（2）微生物酶作用的專一性強，澱粉水解的副反應少，因而水解糖液的純度高，澱粉轉化率（出糖率）高。（3）可在較高澱粉乳濃度下水解，而且可採用粗原料。（4）用酶法制得的糖液顏色淺，較純淨，無異味，品質高，有利於糖液的充分利用。但酶解反應時間較長（48h），需要的設備較多，需要具有專門的培養酶的條件，而且酶本身是蛋白質，易引起糖液過濾困難。但是，隨著酶製劑生產及應用技術的提高，酶製劑的大量生產，酶法制糖逐漸取代酸法制糖已是澱粉水解制糖的一個發展趨勢。第四節澱粉水解糖的製備

3．酸酶結合法酸酶結合法是集中酸法和酶解法制糖的優點而採用的結合生產工藝。根據原料澱粉性質可採用酸酶水解法或酶酸水解法。（1）酸酶法是先將澱粉酸解水解成糊精或低聚糖，然後再用糖化酶將其水解成葡萄糖的工藝。如玉米、小麥等穀類原料的澱粉，澱粉顆粒堅硬，如果用α-澱粉酶液化，在短時間內作用，液化反應往往不徹底。工廠採用澱粉用酸水解到一定的程度（用液化DE表示，一般為10～15），再降溫中和後，用糖化酶進行糖化，此法的優點是酸液化速度快，糖化時間可採用較高的澱粉乳濃度，提高生產效率。酸用量少，產品顏色淺，糖液品質高。DE值表示澱粉水解的程度，指的是葡萄糖（所測的還原糖都以葡萄糖計算）占幹物質的百分比。第四節澱粉水解糖的製備

（2）酶酸法將澱粉乳先用α-澱粉酶液化到一定的程度，然後用酸水解成葡萄糖的工藝。有些澱粉原料，顆粒大小不一（如碎米澱粉），如果用酸法水解，則常使水解不均勻，出糖率低。生產中應用酶酸法，可採用粗原料澱粉，澱粉濃度較酸法要高，生產易控制，時間短，而且酸水解時PH值可稍高些，以減輕澱粉水解副反應的發生。總之，採用不同的水解制糖工藝。各有其優點和存在的問題，但從水解糖液的品質和降低糖耗、提高原料利用率方面來考慮，酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差，從澱粉水解整個過程所需的時間來看，酸法最短，酶解法最長。第四節澱粉水解糖的製備

澱粉水解的中間產物糊精，是若干分子大於低聚糖的碳水化合物的總稱，具有還原性、光性，能溶於水，不溶於酒精，因分子大小的不同，糊精遇碘可呈不同的顏色。隨著澱粉水解程度的增加，糖化液的還原性不斷增加，糖液的甜味越來越濃。這是由於生成的葡萄糖、麥芽糖及低聚糖等具有還原性基團。當葡萄糖值超過60時，由於葡萄糖的複合分解反應產生其他有味物質（如龍膽二糖有苦味）及色澤加深。第四節澱粉水解糖的製備

2.澱粉水解反應動力學參與澱粉水解反應的物質，除澱粉本身以外，還有水和無機催化劑，反應進行的速度理應取決於這三種物質。無機酸是催化劑，其氫離子對於反應具有催化作用，但是在反應過程中並不消耗，酸的濃度應該不變化。水解實際上是澱粉分子與水分子之間的雙分子反應，反應進行的速度取決於兩者的濃度。但在水解情況下，澱粉乳濃度一般較低，水的量較大，雖有一部分水參與反應，但是水的量變化很少，不影響反應速度，於是水解的速率只決定於澱粉的濃度，反應則屬於單分子反映的一級化學反應類型。第四節澱粉水解糖的製備

據研究，水解反應速率常數k與下列幾個因素有關，並建立關係式如下。K=α﹒cN﹒δ﹒γ式中α--催化劑的活性常數，因不同種類的酸，其H+解離程度不同，由實驗測定HCl的H+能夠100%解離。其α=1,H2SO4為0.5～0.52，H3PO4為0.3，CH3COOH為0.025，HBr為1.7，因此，鹽酸是一種良好的催化劑；cN--酸性物質的摩爾濃度（當量濃度）；δ--多糖的水解性常數，可以衡量各種多糖水解的難易程度，如棉花為1，則澱粉為400，稻草為20～25，半纖維素為10～4000，蔗糖為100000；第四節澱粉水解糖的製備

γ--溫度對水解速率影響的常數，即在水解過程中，溫度可以加速澱粉水解的完成，這個數值可以由實驗測定。有人曾以0.1%的HCl於不同溫度下水解澱粉，計算反應速率常數k值，發現溫度升高10℃，反應速度增加3倍。從上述情況可以看出，澱粉水解所用的催化劑的種類、濃度、反映溫度均對水解反應速度有很大的影響，是水解中必須注意的主要因素。除以上因素外，澱粉水解時，葡萄糖的複合和分解反映也需加考慮。第四節澱粉水解糖的製備

3.葡萄糖的複合反應在澱粉的酸水解過程中，水解生成的葡萄糖受到酸和熱的催化影響，能通過糖苷鍵相聚合，失掉水分，生成二糖、三糖和其他低聚糖，這種反應稱為複合反應。複合反應是可逆的。兩個葡萄糖分子通過複合反應相聚合，並不是經過α-1，4鍵聚合成麥芽糖，而是經過α-1，6鍵聚合成異麥芽糖和經過β-1，6鍵聚合成龍膽二糖。對葡萄糖生產來說，複合反應是有害的，它降低葡萄糖的收率，影響葡萄糖的結晶，1份複合糖（或非葡萄糖質）能阻止2份葡萄糖結晶。而且水解液中多數複合糖不能被微生物利用。另外，複合糖的存在也將使谷氨酸發酵的殘糖增加，並抑制谷氨酸菌的生長繁殖，使糖酸轉化率降低，增加谷氨酸的提取和精製的困難。第四節澱粉水解糖的製備

4．葡萄糖的分解反應葡萄糖受到熱的影響發生分解反應，生成5-羥甲基糠醛的性質不穩定，可進一步分解成乙醯丙酸、蟻酸和有色物質等，這些分解物又能聚合成其他物質，反應是很複雜的。在澱粉酸糖化過程中，葡萄糖因分解反應所損失的量並不多，經實驗測定約在1%以下，但所生成的5-羥甲基糠醛是產生色素的根源，有色物質的存在，將增加糖化液精製困難。試驗結果表明，5-羥甲基糠醛和有色物質的生成規律是一致的。當5-羥甲基糠醛含量高時，色素回深，色素的生成量隨葡萄糖濃度的增加而增加，隨反應時間的延長而增加且與pH值有關系，pH=3時，色素物質形成得最少。

第四節澱粉水解糖的製備

pH>3或pH<3，色素物質形成都多。在上述反應的同時，由於澱粉原料中尚含有少量的蛋白質、脂肪等物質，通過水解生成氨基酸、甘油和脂肪酸等非糖物質，，氨基酸與葡萄糖化合生產氨基糖。。氨基糖會引起細菌細胞的收縮，對菌體發酵不利。澱粉經水解反應生成葡萄糖，同時在整個水解過程中，由於受到酸和熱的作用，一部分葡萄糖發生複合反應和分解反應。其中，澱粉的水解反應是主要的，葡萄糖的複合和分解反應是次要的。複合反應和分解反應的發生對葡萄糖的生長是不利的。不僅影響葡萄糖的生產率，而且影響氨基酸發酵的產酸及工廠的生產成本。如何掌握澱粉糖化過程所發生的變化，合理控制水解條件，盡可能降低複合、分解反應的發生，是糖化過程中需要加以解決的問題。第四節澱粉水解糖的製備

三、澱粉酸水解工藝1．澱粉酸水解的工藝流程原料（澱粉、水、鹽酸）→調漿→糖化→冷卻→中和、脫色→過濾除雜→糖液2．澱粉酸水解條件的控制及對糖液品質的影響澱粉的酸水解過程，必須先將原料調成粉漿，保持一定的濃度及PH值，然後將料液打入糖化鍋，在一定條件下進行水解糖化。由於澱粉的濃度、酸的濃度及糖化時間對澱粉的水解反應、葡萄糖的複合反應、葡萄糖的分解反應都有直接的影響。因此，在酸法糖化中，必須合理一加以調節控制。希望將澱粉水解完全轉變為葡萄糖，限制複合反應和分解反應的發生，使其達到最低程度。第四節澱粉水解糖的製備

（1）澱粉乳濃度的選擇澱粉水解時，澱粉乳的濃度越低，水解液的葡萄糖值越高，色澤越淡。因濃度低，有利於澱粉的水解反應，而不利葡萄糖的複合反應；澱粉乳的濃度高，則有利於複合、分解反應的發生。隨著澱粉乳濃度的降低，糖液中葡萄糖值增加。當澱粉乳濃度從19波美度降到18波美度時，水解糖液DE值變化幅度最大，約上升1。47%；若澱粉乳濃度繼續下降，糖液DE值雖然繼續上升，但上升的幅度不太顯著。相反，澱粉乳濃度越高，糖液的DE值越低。在工業生產中，各廠都根據澱粉質原料的情況，制定自己的水解澱粉漿濃度範圍。薯類澱粉較易水解，濃度可稍高一些；精製澱粉比粗澱粉的濃度可高些；在設備充分的條件下，水解濃度可低些。第四節澱粉水解糖的製備

（2）酸的種類和用量許多酸對澱粉的水解反應均有催化作用，但工業上普遍使用的是催化效率較高的鹽酸、硫酸和草酸。酸在糖化過程中是一種催化劑，從理論上說，糖化前後其量保持不變。但由於澱粉中有雜質，如蛋白質、脂肪、灰分等成分都能降低酸的有效濃度。蛋白質分解成氨基酸，是兩性化合物，消耗一部分酸與之中和；灰分中的磷酸鹽也能與酸反應，消耗一部分酸；糖化中蒸汽也能帶走一部分酸。因此，致使實際耗酸量大大超過理論量。一般用鹽酸量占幹澱粉的0.6%～0.7%，pH值調至1.5左右。第四節澱粉水解糖的製備

（3）糖化的壓力和時間澱粉水解是用蒸汽直接進行加熱的。溫度與壓力為相同的指標，溫度隨壓力升高而升高。因此，常以壓力為控制因素。壓力與水解反應速率成正比，壓力升高，水解反應速度加快。因此，在澱粉水解時，為要加快水解速度，提高設備的生產能力，可採用增大水解反應壓力的方法。掌握糖化終點，控制糖化時間，是十分重要的。當糖液的葡萄糖值達到最高點後既不再上升，相反的會隨著糖化時間的延長而稍有下降。這時如果不及時放料，勢必事倍功半。第四節澱粉水解糖的製備

3．糖化設備結構對糖液品質的影響澱粉水解反應都是在糖化鍋內進行的。糖化鍋的結構對糖液品質有影響。為了保證糖化均勻，使糖液達到最高葡萄糖純度後，能迅速從鍋內放出，糖化鍋的容量一般不宜過大。容積過大，會延長進出料的時間，澱粉水解時間差別大，部分先水解葡萄糖將易發生複合、分解反應；蒸汽量不足和不穩定的情況下，常使水解時間加長，帶來不良後果；鍋體太高，會造成鍋內上下部的水解速率相差較大，放料時難保證下部的先出料；鍋體太矮，必須增大鍋體直徑而造成鍋內死角區，使糖化不均勻而使局部澱粉結塊，影響糖化進行。一般谷氨酸廠採用糖化鍋徑高比1：1.5左右。另外，糖化鍋的附屬管道應保證進出料迅速，物料受熱均勻，有利於升壓，有利於消滅死角，儘量縮短加料、放料、升溫、升壓等輔助時間。實踐證明，輔助時間縮短，糖液的葡萄糖值高，色素淺。第四節澱粉水解糖的製備

4．水解糖液中和脫色除雜在澱粉水解的糖液中，除了澱粉的水解產物葡萄糖、麥芽糖等單糖及低聚糖外，澱粉原料中還含有其他物質（如蛋白質、脂肪、纖維素、無機鹽等複合物），它們在水解過程中也發生變化。如蛋白質的水解產物--氨基酸能與葡萄糖反應，使糖液色澤加深。蛋白質及其他膠體物質的存在將使谷氨酸發酵時泡沫增加。同時糖化是在較高酸度下進行的，糖化液的pH值低，因此，必須加以中和、脫色、除雜，才能供發酵使用。第四節澱粉水解糖的製備

（1）中和從糖化鍋出來的糖化液溫度很高（140～150℃），需經冷卻才能進行了中和，中和是降低糖液的酸度，調節pH值使糖液中膠體物質析出，便於過濾除去。生產中使用的中和劑有純鹼和燒鹼，純鹼（Na2CO3）溫和，糖液品質好，但產生的泡沫多，生產中難以控制。使用燒鹼，就將燒鹼配成NaOH，濃度過高易造成局部過堿，葡萄糖焦化而產生焦糖，焦糖能抑制谷氨酸菌的生長，增加色澤，難以精製。中和時應將Na2CO3化成堿水緩慢進行，否則由於局部鹼性過大，複合物和分解物易形成，造成糖的損失，增加提取的困難。要求邊中各邊測PH值，保持PH值在4.6～5.0之間。一般在中和操作中注意控制中和溫度為60～70℃。溫度高，脫色效果較差；溫度低將使糖黏度增大，難過濾。第四節澱粉水解糖的製備

（2）脫色、除雜水解糖液中存在雜質，對菌體發酵不利，也影響產品的提煉，需進行脫色除雜處理。其方法有活性炭吸附法、離子交換法、新型磺化煤脫色。活性碳表面積大，有無數微小的孔隙，它可將雜質、塵埃、色素吸附掉；同時，活性炭也有濾作用。活性碳吸附工藝簡單，脫色效果好，操作容易。一般活性炭用量相當於澱粉量的0.6%～0.8%。脫色溫度一般為65℃。因溫度影響吸附，溫度高，吸附能力差，脫色較長，雜質除不乾淨；反之，溫度過低，料液中雜質發黏，不易吸附，過濾困難。脫色PH值為4.6～5.0，在酸性條件下，活性碳脫色能力強。脫色時加活性炭後，攪拌30分鐘，混勻使活性炭與雜質充分接觸。活性炭用後可用水洗滌，可在下次摻入新炭繼續使用，降低成本。第四節澱粉水解糖的製備

離子交換樹脂，具有選擇性強，脫色效果較好，便於管道化、連續化及自動化操作，減輕勞動強度的優點。由於目前國產樹脂選擇性較差，脫色能力較低，而且價格高。新型磺化煤不同於一般的磺化煤，它具有粒度細（40～120目）、脫色力強的特點。這種磺化煤尚可直接用於澱粉糖化。在澱粉加酸糖化時，加入澱粉量1.8%的磺化煤粉一起糖化。當糖