制备单克隆抗体的基本流程及原理

制备单克隆抗体的基本流程及原理单克隆抗体（mAb）源于单一B细胞克隆，具有高度的均一性和特异性，仅针对某一特定抗原表位。在生物医学研究、疾病诊断以及某些疾病治疗（如传染病和癌症）中，单克隆抗体发挥着至关重要的作用。目前，制备单克隆抗体的主流技术包括杂交瘤技术、噬菌体抗体库技术和单个B细胞技术。杂交瘤技术通过融合免疫小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，筛选出能够特异性分泌抗体的杂交瘤细胞，进而生产并纯化得到单克隆抗体。噬菌体抗体库技术则利用基因工程技术，将抗体基因与噬菌体基因相连接，使抗体以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，通过与靶蛋白的结合，筛选出具有特定亲和力的噬菌体展示抗体。而单个B细胞技术则基于每个B细胞仅含有一对功能性的重链和轻链，每个B细胞仅产生一种特异性抗体的特性，直接从单个B细胞中扩增抗体基因，从而获得单克隆抗体。制备单克隆抗体的基本流程：1）抗原制备一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。义翘神州在蛋白抗原、多肽抗原制备积累了丰富的经验，可提供专业的抗原制备服务。另外，义翘神州还成功制备出6000多种重组蛋白产品，可作为抗原用于动物免疫和抗体筛选，欢迎订购。2）动物免疫通常选用Balb/c小鼠作为免疫动物，根据抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原纯度、抗原量、免疫方法和途径等。免疫方法一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射和静脉注射。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原+不加佐剂，皮下或静脉注射）、第四次免疫（抗原+不加佐剂，静脉注射）。3）细胞融合细胞融合前准备：脾淋巴细胞制备：取已经免疫的Balb/c小鼠的脾脏，制备淋巴细胞，通常每只小鼠可得1x10^8-2.5x10^8个脾细胞；同时摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，便于细胞融合以及产生大量Ab。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功得到杂交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前不能少于1周；冻存的细胞在复苏后要生长2周才能处于适合于融合的状态。饲养细胞：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制可能是释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（PEG）介导细胞融合、电融合。PEG融合相邻骨髓瘤和/或抗体分泌细胞的质膜，形成具有两个或更多核的单细胞。异核体保留这些核，直到核膜在有丝分裂前溶解。电融合通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比PEG更加有效，结果具有重现性。4）杂交瘤筛选以及单克隆鉴定骨髓瘤细胞和脾细胞融合之后，由于细胞融合是随机的，因此要利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT），对氨蝶呤钠敏感，在HAT选择培养液中不能生长；免疫脾细胞虽然有HGPRT，但不能在体外无限繁殖。因此只有融合的杂交瘤细胞，才能在HAT选择培养液中无限繁殖。得到融合的杂交瘤细胞后，需要进一步筛选特异性抗体。将融合的细胞进行充分有限稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞，这一过程常被称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹水培养。5）单克隆抗体大量制备利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。单层细胞培养法是各个实验室最常用的，是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以1.0X10^6~2.0X10^6个/mL为宜，然后收集培养上清液。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。义翘神州提供杂交瘤体外培养抗体生产服务，成功率>99%，可采用低血清或无血清培养基进行高密度悬浮培养，生产规模从毫克级到克级不等，满足客户的不同需求。腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单以及不需要复杂的培养条件。