11DNA重组技术基本工具

专题1基因工程§1-1DNA重组技术的根本工具基因工程的概念基因工程：指按照人们的愿望,进展严厉的设计并经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,发明出更符合人们需求的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子程度上进展设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术或基因拼接技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程原理目的基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子程度定向改造生物的遗传性状剪切→拼接→导入→表达基因重组基因工程的概念了解问题讨论：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想：需求做哪些关键任务？普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因普通棉花(无抗虫特性)棉花细胞(含抗虫基因)与运载体DNA拼接，导入棉花植株(有抗虫特性)表达基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合〞关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞处理培育抗虫棉的关键步骤需求哪些工具？“分子手术刀〞——限制性核酸内切酶“分子缝合针〞——DNA衔接酶“分子运输车〞——基因进入受体细胞的载体§1-1DNA重组技术的根本工具“分子手术刀〞──限制酶“分子缝合针〞──DNA衔接酶“分子运输车〞──基因进入受体细胞的载体识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物分别纯化出来4000种。1、来源：2、种类：3、作用：5、结果：构成两种末端一、“分子手术刀〞——限制性核酸内切酶黏性末端平末端4、切割方式：错位切和平切ATGCATGC限制酶切割磷酸二酯键限制性内切酶作用过程点击播放1、大肠杆菌的一种限制酶〔EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开构成黏性末端。2、SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割构成平末端。常见的两种限制酶SmaⅠ平末端平末端

EcoRⅠ黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。寻根问底他能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中构成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的损害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证本身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而到达维护本身的目的。为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？经过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者经过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，虽然细菌中含有某种限制酶也不会使本身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。寻根问底1、要想获得某个目的基因必需求用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。2、假设把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生一样的黏性末端。3、是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?实践还不够,还需求DNA衔接酶进展衔接。思索与探求ATGCATGC衔接酶衔接磷酸二酯键DNA衔接酶的作用过程：二、分子缝合针——DNA衔接酶作用部位：是磷酸二酯键〔扶手〕不是氢键〔梯子〕DNA衔接酶将两条DNA链衔接起来的酶。类型E·coliDNA衔接酶T4DNA衔接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能衔接黏性末端能衔接黏性末端和平末端(效率较低)一样点差别衔接酶种类：两DNA片段要具有互补的黏性末端才干拼起来DNA衔接酶的缝协作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合〞起来，留意：DNA衔接酶可衔接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能衔接单链DNA！DNA衔接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA衔接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合〞起来，但效率较低DNA衔接酶的缝协作用AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化构成磷酸二酯键都是蛋白质 不需求需求构成完好的重组DNA分子构成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA衔接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸衔接到已有的DNA片段上，构成磷酸二酯键在两个DNA片段之间构成磷酸二酯键1、外源基因(如抗虫基因)怎样才干导入受体细胞(如棉花细胞)？“分子运输车〞——载体。2、载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进展大量复制。〔随载体的复制而复制〕三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车〞——载体常用的载体主要有两类：1〕细菌细胞质的质粒2〕噬菌体或某些动植物病毒原理：病毒，细菌等的侵染性。认识常用的载体——质粒质粒主要存在于细菌和酵母菌体内。质粒是一种裸露的、构造简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子。质粒的特点：1、细菌染色体外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标志基因议一议2、能否用SARS病毒作为基因载体？3、作为载体，假设没有切割位点将怎样？4、携带目的基因的载体能否进入了受体细胞，如何鉴定？5、假设目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链DNA不能不能进展DNA的重组载体上应有标志基因能够呵斥基因丧失1〕可以在宿主细胞中自我复制并稳定地保管。2〕具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因衔接。3〕具有某些标志基因，便于进展挑选。4〕必需是平安的，不会对受体细胞有害。5〕大小应适宜，便于提取和操作

作为运载体的必要条件留意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的小结：基因工程的工具限