11DNA重组技术的基本工具(正式)

基因工程专题1每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌消费胰岛素，大大降低了消费本钱。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思索：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用基因工程的产物什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望，进展严厉的设计，并经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而发明出更符合人们需求的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子程度上进展设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的概念基因工程的概念：基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的志愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程DNA重组技术生物体外基因DNA分子程度剪切→拼接→导入→表达问题讨论：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需求做哪些关键任务？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因经过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合〞关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路早期根底实际达尔文提出生物进化论根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路早期根底实际孟德尔提出基因的分别定律和自在组合定律根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路早期根底实际摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路后期根底实际艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路后期根底实际沃森、克里克提出DNA的双螺旋构造模型。根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路后期根底实际梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保管复制根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路后期根底实际克里克等提出中心法那么DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路后期根底实际1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的胜利6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明处理培育抗虫棉的关键步骤需求哪些工具？“分子手术刀〞——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合〞关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针〞——DNA衔接酶“分子运输车〞——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的根本工具一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀〞1.主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分别纯化产生黏性末端或平末端Goon大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成寻根问底他能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中构成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的损害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证本身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而到达维护本身的目的。Goback⒉种类与命名：如今曾经从约300种微生物中分别出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌〔Serratiamarcesens〕大肠杆菌〔EscherichiacoliR〕Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分别到3种限制酶，那么分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ磷酸二酯键T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+O限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键翻开构成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制性内切酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，构成片段的DNA.切割磷酸二酯键，构成单个的脱氧核苷酸。Goback限制酶的识别序列：能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端反复演示Goback什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端要想获得某个特定性状的基因必需求用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。假设把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生一样的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思索?……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段衔接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一种DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA衔接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸衔接到已有的核酸片段上，构成磷酸二酯键构成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间构成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸经过磷酸二酯键衔接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时衔接起来，不需求模板可把黏性末端之间的缝隙“缝合〞起来，E·coliDNA衔接酶或T4DNA衔接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA衔接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合〞起来，但效率较低T4DNA衔接酶二、“分子缝合针〞——DNA衔接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸衔接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键构成③类型：类型E·coliDNA衔接酶T4DNA衔接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能衔接黏性末端能衔接黏性末端和平末端(效率较低)一样点差别三、“分子运输车〞——基因进入受体细胞的载体⒈载体需求的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标志基因，便于挑选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒⑶假设目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有料想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，假设没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，他会用它来做分子运输车吗？⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一同复制有切割位点有标志基因的存在，可用含氨苄青霉素的培育基鉴别思索与探求P7〔2〕为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？经过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者经过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，虽然细菌中含有某种限制酶也不会使本身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体运用的DNA分子很多都是质粒〔plasmid〕，即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。能否任何质粒都可以作为基因工程载体运用呢？不是，作为基因工程运用的载体必需满足以下条件：思索与探求P71〕载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必需是在质粒本身需求的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2〕载体DNA必需具备自我复制的才干，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3〕载体DNA必需带有标志基因，以便重组后进展重组子的挑选。4〕载体DNA必需是平安的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5〕载体DNA分子大小应适宜，以便提取和在体外进展操作，太大就不便操作。实践上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进展人工改造后才干用于基因工程操作。4、DNA衔接酶有衔接单链DNA的身手吗？迄今为止，所发现的DNA衔接酶都不具有衔接单链DNA的才干，至于缘由，如今还不清楚，也许未来会发现可以衔接单链DNA的酶。思索与探求P71.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需运用〔〕同种限制酶B.两种限制酶同种衔接酶D.两种衔接酶A课堂练习2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制