高二生物寒假讲义练习（选择性必修3）第07讲 重组DNA技术的基本工具（教师卷）

第07讲重组DNA技术的基本工具【学习目标】1.阐明重组DNA技术所需的三种工具的作用。2.提升对基因工程的理解能力，能够合理分析在基因水平产生的问题。3.了解进行DNA的粗提取和鉴定的原理，进行DNA的粗提取和鉴定的操作。3.认同基因工程的作用及意义，认识到生物技术的发展离不开理论研究和技术创新。【基础知识】一、基因工程的概念项目具体内容操作对象基因原理基因重组操作环境体外操作水平分子水平结果获得人们需要的新的生物类型和生物产品优点克服远缘杂交不亲和的障碍;定向改造生物的性状二、限制性核酸内切酶（1）来源：主要从原核生物中分离出来。（2）种类：约4000种（3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。（4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。②在中轴线处切割，形成平末端。如：SmaI限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开。总结归纳1.限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。2.限制作用实际就是限制酶降解\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。一般不切割自身的DNA分子，是由于甲基化的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护，通过\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。3.根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ类酶。其中，Ⅱ类酶有EcoRI、BamHI、HindⅡ、HindⅢ等，在所识别的特定\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"碱基序列上有特定的酶切位点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"电泳法进行分离、鉴别。4.限制酶识别DNA序列中的回文序列。回文序列指的是双链\t"/item/%E5%9B%9E%E6%96%87%E5%BA%8F%E5%88%97/_blank"DNA或\t"/item/%E5%9B%9E%E6%96%87%E5%BA%8F%E5%88%97/_blank"RNA分子中的特定的核苷酸片段，该片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。例如，DNA序列ACCTAGGT之所以是回文序列，是因为它的互补序列是TGGATCCA，而反向互补序列是ACCTAGGT，和其原来序列一致。有些限制酶的切割位点在回文的一侧（如EcoRI、BamHI、Hind等），因而可形成粘性末端；另一些Ⅱ类酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、SmaI等，切割位点在回文序列中间，形成平末端。三、DNA连接酶(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。(2)类型：归纳总结1.DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"ATP的DNA连接酶；另一类是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD+的DNA连接酶。DNA连接酶是通过催化形成磷酸二酯键把两条DNA（双股或是单股DNA）黏合成一条。2.教材中提到的E·coliDNA连接酶，来源于\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"大肠杆菌，可用于连接\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"粘性末端；\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。E·coliDNA连接酶对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"羟基之间形成\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"磷酸二酯键。四、基因进入受体细胞的载体（1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。（2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等（3）最常用载体：质粒特点：①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。②有一个至多个限制酶切割位点。③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。⑤对细胞无毒无害。⑥大小适中，便于提取和操作。归纳总结1.基因工程中常用的运载体主要有两类：一类运载体是噬菌体或某些病毒等。另一类是细菌细胞质的\t"/item/%E8%BF%90%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核之外的环状DNA，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。2.质粒作为载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。3.质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA，也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。克隆位点是\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"限制性内切酶切割位点，\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。一般地，载体都含有多克隆位点，\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"多克隆位点的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段，可以针对\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"插入片段提供特定的\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"酶切位点图谱，防止插入片段插入不恰当的位置，在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。编码抗生素抗性的基因是最普遍的细菌选择性标志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因和\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"卡那霉素抗性基因四种。五、DNA的粗提取和鉴定（一)提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（二)提取DNA的基本原理1.DNA在NaCl中的的溶解性：在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性（1）对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。3.DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。（三）DNA的鉴定沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色归纳总结实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

2.破碎细胞，获取含DNA的滤液

如果是动物细胞，则破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

3.去除滤液中的杂质：

法一：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。法二：是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA，从而使提取的DNA与蛋白质分开；法三：是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

【考点剖析】考点一：限制性内切酶例1．图甲表示某环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcoRⅠ）完全酶切后的片段电泳结果若改变条件使其酶切不充分就有可能获得如图乙所示的电泳结果（Kb即千个碱基对）。下列叙述错误的是（

）A．该DNA分子全长至少为7Kb，该DNA分子中至少含有4个EcoRⅠ酶切位点B．反应时间越长，得到图甲结果的可能性越大C．限制性核酸内切酶主要来自原核生物，化学本质都是蛋白质D．适当增加EcoRⅠ浓度，更可能得到图乙的结果【答案】D【解析】据题意和图示分析可知：环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四种长度的DNA片段，说明该DNA分子全长至少为7Kb，至少含有4个EcoRⅠ酶切位点。反应时间越长或适当增加EcoRⅠ浓度，DNA被切割越彻底，得到图甲结果的可能性越大。环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四种长度的DNA片段，说明该DNA分子全长至少为7Kb，环状DNA分子，可以被限制性核酸内切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到至少4个DNA片段，说明该DNA分子中至少含有4个EcoRⅠ酶切位点，故A正确；反应时间越长，DNA被切割越彻底，得到图甲结果的可能性越大，故B正确；限制性核酸内切酶主要来自原核生物，限制酶的化学本质是蛋白质，C正确；D、适当增加EcoRⅠ浓度，可得到图甲的结果，故D错误。考点二：DNA连接酶例2．限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶，限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端的DNA片段。据图分析错误的是（

）A．图示三个黏性末端一定由两种不同的限制酶切割产生B．图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端相同C．a点核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，b处核苷酸之间通过氢键连接D．催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子【答案】A【解析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种；DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。切割产生甲的限制酶的识别列为：GAATTC//CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别列为：CAATTG//GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为：CTTAAG//GAATTC，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶催化产生的，A错误；由图可知，甲、乙的黏性末端相同，均为AATT—，丙的黏性末端为TTAA—，因此图示中共有两种黏性末端，B正确；a点属于两个核苷酸之间通过磷酸二酯键连接成链，b点属于两条链之间的核苷酸，通过氢键相连，C正确；切割甲的限制酶的识别列为：GAATTC//CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG//CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。考点三、基因工程的载体例3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是（

）A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中 B．细菌的基因只存在于质粒上C．质粒为小型环状DNA分子 D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一【答案】C【解析】基因工程常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中，病毒中没有质粒，A错误；细菌基因主要存在于拟核DNA上，也有少数存在于质粒上，B错误；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核外或拟核外的细胞质基质中，C正确；质粒是基因工程中的重要工具之一，但不是工具酶，基因工程中的工具酶是限制酶和DNA聚合酶，D错误。考点四、DNA的粗提取和鉴定例4．如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是（）A.图1中溶液a是0.14

mol•L-1的NaCl溶液

B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶

C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显

D.图2试管1的作用是证明2

mol•L-1

NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色【答案】C【解析】图1中溶液a是2mol•L-1的NaCl溶液，A错误；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，B错误；图2所示实验操作中有一处明显错误（试管2中未将DNA溶于2mol•L-1的NaCl溶液中），可能导致试管2中蓝色变化不明显，C正确；图2试管1的作用是证明2

mol•L-1

NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D错误。

【真题演练】1.(2021山东高考，13)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（）A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精D.加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0．14mol/L【答案】A【解析】木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。2.（2020海南高考生物，10）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（）A.羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料B.提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐C.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解D.在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色【答案】A【解析】羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。3.（2018•北京）用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（）A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA【答案】D【解析】酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；图2中酶切产物可用于构建重组DNA，B正确；分析图1，限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4个DNA片段，泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物，C正确；图中被酶切的DNA片段是双链DNA，D错误。4.（2017•北京）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（）A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上【答案】C【解析】据图分析可知，在目的基因的两端、启动子和终止子之间都有限制性核酸内切酶EcoRⅠ的切割位点，因此可以用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割目的基因和运载体，之后再用DNA连接酶连接形成基因表达载体，A正确；将目的基因导入到植物细胞，常用农杆菌转化法，可以将目的基因C导入到农杆菌的Ti质粒的T﹣DNA段，之后再用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞中染色体上的DNA上，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的农杆菌，C错误；要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子杂交技术，D正确。5．（2023·全国乙卷高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。回答下列问题：（1）常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。【答案】（1）EcoRI、PstIEcoRI、PstI、SmaI和EcoRV（2）磷酸二酯键（3）自我复制一至多个限制酶切位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程【解析】（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E.coliDNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。6.（2021海南）25．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题。（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。【答案】（1）DNA连接酶（2）感受态细胞法（3）碱基互补配对原则目标DNA特定的核苷酸序列（4）DNA分子杂交技术出现杂交带（5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。【解析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（3）根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。（4）可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若出现杂交带，则说明基因敲除成功。（5）根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。7.（2021辽宁，24）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。相关限制酶的识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRIG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstICTGC↓AGGA↑CGTCKpnIG↓GTACCCCATG↑GBamHIG↓GATCCCCTAG↑G注：箭头表示切割位点（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。【答案】（1）逆转录（2）①.EcoRI②.PvitⅡ③.T4DNA连接酶（3）感受态（4）3（5）G2/M【解析】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。（5）比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。【过关检测】1.在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列关于限制酶的叙述错误的是()A.限制酶主要是从原核细胞中获取的B.每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列C.限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键D.同一种限制酶切割不同的DNA分子可产生碱基互补配对的黏性末端【答案】C【解析】限制酶主要从原核细胞(细菌)中获取,A正确;限制酶具有特异性,每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点进行切割,B正确;限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的磷酸二酯键,C错误;同一种限制酶切割不同的DNA分子可产生碱基互补配对的黏性末端,D正确。2.下表为4种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是()限制酶1—↓GATC—限制酶2—CATG↓—限制酶3—G↓GATCC—限制酶4—GG↓CGCC—A.在使用限制酶的同时还需要解旋酶B.限制酶1和3切割DNA分子产生的黏性末端相同C.图中限制酶的识别序列都由4个核苷酸组成D.限制酶4作用后产生的是平末端【答案】B【解析】限制酶能识别双链DNA的特定核苷酸序列并在特定位点进行切割,在使用限制酶时,不需要解旋酶,A错误;限制酶1和3切割DNA分子,产生的黏性末端相同,均为GATC,B正确;限制酶3和4识别的序列分别是—GGATCC—和—GGCGCC—,均由6个核苷酸组成,C错误;限制酶4切割后产生的是黏性末端,D错误。3.以下是几种不同限制性核酸内切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的叙述中,正确的是（

）A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B．②片段是在酶切位点为的限制酶作用下形成的C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下形成的重组DNA分子D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键【答案】D【解析】分析题图可知：①④是同一种限制酶切割形成的，具有相同的黏性末端；②经过限制酶切割后形成的是黏性末端；③经过限制酶切割后形成的是平末端。图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此①～④DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；切割②片段的限制酶的识别序列为GAATTC，识别位点为GA之间，B错误；由于①④具有相同的黏性末端，所以能用DNA连接酶连接起来，形成重组DNA分子，C错误；限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键，其中限制酶能将磷酸二酯键切断，而DNA连接酶能将磷酸二酯键连接起来，D正确。4.DNA连接酶是基因工程的必需工具,下列有关DNA连接酶的叙述,正确的是 ()A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子B.DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成D.E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端【答案】C【解析】DNA连接酶可以连接互补配对的黏性末端或平末端,而非任意的两个DNA片段,A错误;DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列,B错误;DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成,C正确;E.coliDNA连接酶仅能连接黏性末端,T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端,D错误。5.作为基因工程的运输工具——载体,必须具备的条件及理由对应错误的是 ()A.能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制,以便提供大量的目的基因B.具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入C.具有某些标记基因,以便目的基因能够准确定位与其结合D.对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动【答案】C【解析】载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便通过复制提供大量的目的基因,A正确;载体必须具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入,B正确;载体必须具有某些标记基因,以便于重组后进行重组DNA分子的筛选,C错误;载体对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动,D正确。6.[2023宁夏石嘴山高三月考]在重组DNA技术中,将外源基因导入受体细胞,通常利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述,正确的是 ()A.质粒是一种只存在于原核细胞中的、结构简单的环状DNA分子B.质粒的复制和表达过程遵循中心法则和碱基互补配对原则C.外源基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达D.大多数天然质粒都不需要人工改造,可以直接作为载体使用【答案】B【解析】质粒是存在于许多原核细胞以及真核细胞中的具有自主复制能力的小型环状DNA分子,A错误;质粒的复制和表达遵循中心法则,也遵循碱基互补配对原则,B正确;质粒能独立自主复制并稳定存在,因此含有外源基因的质粒在受体细胞中可以独立表达,外源基因不一定非要整合到受体细胞的DNA中才能表达,C错误;天然的质粒不能直接被用作载体,基因工程中真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,D错误。7.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 ()A.该实验不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料B.将洋葱研磨液置于4℃冰箱中能防止DNA被降解C.该实验中加入体积分数为70%的预冷酒精可用来析出、纯化DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热【答案】C【解析】由于哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器,因此不能作为提取DNA的材料,A正确;洋葱研磨液放在4℃的冰箱中可以使酶的活性降低,防止DNA降解,B正确;提纯DNA时,加入的是预冷的、体积分数为95%的酒精溶液,C错误;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会呈现蓝色,D正确。8.如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是()A.将图1中的研磨液过滤后保留沉淀B.图2过程,用玻璃棒进行快速交叉搅拌会使DNA析出更快C.图2析出得到的白色丝状物只能溶于2mol/L的NaCl溶液D.图3对提取后的DNA进行鉴定,两支试管中均要加入二苯胺试剂【答案】D【解析】图1中新鲜洋葱研磨后DNA存在于研磨液中,过滤后应保留滤液,A错误;图2过程,用玻璃棒要轻轻搅拌且搅拌要沿同一方向进行,防止DNA分子被弄断,B错误;图2析出得到的白色丝状物主要成分是DNA,DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高,并不是只能溶于2mol/L的NaCl溶液,C错误;图3对提取后的DNA进行鉴定,作为对照,两支试管中均要加入二苯胺试剂,D正确。8.下列有关基因工程工具的叙述,错误的是 ()A.限制性内切核酸酶只能用于切割获取目的基因B.能连接黏性末端的DNA连接酶不一定能连接平末端C.DNA连接酶缝合两个黏性末端时有氢键的重新连接D.基因工程中使用的载体有质粒、某些动植物病毒及噬菌体【答案】A【解析】限制性内切核酸酶不仅能用于切割获取目的基因,也能切割质粒,A错误;从大肠杆菌中分离的E.coliDNA连接酶仅能连接黏性末端,而从T4噬菌体中分离的T4DNA连接酶既可以连接黏性末端,也可以连接平末端,因此能连接黏性末端的DNA连接酶不一定能连接平末端,B正确;DNA连接酶缝合两个黏性末端时有碱基的互补配对,因此有氢键的重新连接,C正确;质粒、某些动植物病毒及噬菌体都是基因工程中使用的载体,D正确。9.现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子,用限制性内切核酸酶完全酶切后,进行凝胶电泳,使酶切产物分开。