第一章-第五章微生物化妆品

日用化工产品检验与分析员培训

微生物检验部分微生物概述化妆品与微生物化妆品卫生标准化妆品微生物标准检验方法日用化工产品检验分析员培训讲座（微生物检验）

第一章概述

一、微生物的概念

二、微生物的特点任何一种化妆品，在生产、保存、运输和使用过程中，由于各种不同的原因，其产品质量可能发生质变。其原因之一就是由微生物造成的，微生物是一群形体极微小的生物，如细菌、酵母菌、霉菌和病毒等。化妆品受到微生物的污染，可引起产品物理性状(如色泽、气味等)变化，改变产品有效成分，有的还会引起致敏、毒素和病毒感染，因此必须严格控制化妆品中的微生物，微生物对化妆品所产生的作用和影响愈来愈受到重视。在本书中将介绍与化妆品有关的一些微生物学基本知识。微生物的概念微生物是一类个体微小、结构简单，肉眼不可见或不清楚的微小生物的统称。与人类密切相关。例：（1）自来水（2）流行性疾病：红眼病、非典、禽流感

（3）化妆品：口红、眼霜（皮肤病）

（4）食品方面：食用醋——醋酸杆菌味精——棒状杆菌啤酒——酵母菌面包——酵母菌

（6）日用化工方面：加酶洗涤剂、加酶牙膏（产品质量好，生产率高）（7）医药方面：青霉素、链霉素——产黄青霉菌、放线菌（8）农业方面：发酵饲料等等。微生物类群十分庞杂，包括病毒、细菌、放线菌、支原体、酵母菌、霉菌等。与化妆品关系密切的微生物主要是细菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、破伤风杆菌等）和霉菌。微生物的特点特点——微生物广泛地应用于工农业生产1．分布广、种类多2．生长旺、繁殖快3．适应强、易变异4．代谢强、转化快微生物的形态一、细菌二、霉菌与化妆品关系密切的微生物多是细菌和真菌类的霉菌。本章主要介绍细菌和霉菌两类微生物。一、细菌

（一）细菌的分类

革兰氏阳性细菌——G+

革兰氏阴性细菌——G-显微镜下菌体革兰氏染色反应阴性细菌——红色G-

革兰氏染色阳性反应细菌——深紫色G+（二）细菌的形态细菌的种类繁多，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状三种，分别称为球菌、杆菌和螺旋菌。

1、球状——球菌（呈球形或椭圆形）单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌（细胞无定向分裂，犹如串葡萄。）球菌形态杆菌螺旋菌

2、杆状—杆菌细胞呈杆状或圆柱形短杆菌近似球状，长的杆菌近丝状。杆状菌是细菌中种类最多的，也有不少是致病菌。

3、螺旋状——螺旋菌（再分为弧菌和螺旋菌两种状态）。杆菌螺旋菌形态(三)细菌的大小

细菌大小随种类不同差别很大，平均大小为1～3μm

球菌大小以其直径表示0.5～2μm

杆菌和螺旋菌以其长度与宽度表示

1～5μm×0.15～1.5μm(四)细菌的细胞结构细菌的结构可分为基本结构和特殊结构两部分1.基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核、核糖体和内含物，2.特殊结构：鞭毛、荚膜、芽孢和气泡等，只在部分细菌中发现。

(五)细菌的繁殖

吸收营养物质生化合成反应营养物质转变成新的细胞物质细胞物质和细胞体积的增加，新的细胞壁物质的合成，使菌体开始了繁殖过程，而最后形成两个新的细胞。裂殖是细菌最普遍、最主要的繁殖方式，(六)细菌的菌落将细菌接种到培养基上，若条件适宜，便迅速生长繁殖，由于细胞受到固体培养基表面和深层的限制，繁殖的菌体常以母细胞为中心聚集在一起，形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细菌群体，称为菌落。不同的菌种所形成的菌落有不同的形态，称之为菌落特征。菌落特征包括大小、形状、隆起形状、边缘情况、表面状态、表面光泽、质地、颜色、透明程度等，如金黄色葡萄球菌的菌落为金黄色，灵杆菌的菌落呈红色。因此菌落的特征可以应用于细菌的鉴定和分类。但需注意，菌落的特征还受到培养条件尤其是培养基成分的影响。

二、霉菌霉菌是一些“丝状真菌”的统称，属真核微生物。霉菌在自然界分布极广，土壤、水域、空气、动植物体内外均有它的踪迹。它们同人类的生产、生活有着密切的关系：(1)有益的方面：生产酒精、青霉素、维生素、植物生长刺激素等(2)有害的方面：食品、谷物由于霉菌引起霉变；霉菌能产生多种毒素如由黄曲霉菌产生的黄曲霉素致癌；霉菌可引起化妆品霉变，是化妆品变质的主要原因。(一)霉菌的形态霉菌菌体是由分枝或不分枝的菌丝构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体。霉菌的菌丝有两类(如图5－5所示)：

(1)无膈膜菌丝，如根霉、毛霉等；

(2)多数为有膈膜菌丝，如青霉菌、曲霉菌均属此类。霉菌的菌丝(二)霉菌的繁殖霉菌的繁殖能力一般都很强，而且方式多样，主要靠形成无性和有性孢子。无性孢子的繁殖是无性繁殖，是不经过两性细胞的配合，只是营养细胞的分裂或营养菌丝的分化而形成同种新个体的过程。（普遍）有性孢子繁殖是经过两个性细胞结合而产生新个体的过程，称为有性繁殖。微生物的营养物质微生物同其他生物一样，需要不断地从它的外部环境中吸收所需要的各种物质，使机体能进行正常的生长与繁殖，保证生命能够维持与延续下去。那些能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质通常称为微生物的营养物质。微生物获得与利用营养物质的过程常称为营养。一、微生物细胞的化学组成

微生物细胞和其他高等动植物细胞一样，也是由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁、锰、铜、钴、锌、钼等化学元素组成。微生物细胞中的这些元素主要以水、有机物和无机盐的形式存在于细胞中。

水是细胞中的一种主要成分，一般可占细胞干重的90％以上。

二、微生物的营养物质

及其功能

营养物质:碳源物质、氮源物质、无机盐和生长因子水。(一)碳源物质凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中碳素来源的营养物质称为碳源物质。

碳源物质通常也是机体生长的能源物质。能作为微生物生长的碳源物质的种类极其广泛，既有简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐等，也有复杂的天然的有机含碳化合物。在化妆品中微生物所能利用的碳源有：

1．碳水化合物与糖甙。如淀粉、糊精和糖。

2．醇类。如甘油、甘露醇、脂肪醇。

3．脂肪酸及其脂类。如动植物油脂及蜡。

4．甾固醇。如胆固醇和羊毛脂。(二)氮源物质凡是能被微生物用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质通称为氮源物质。

多数霉菌能直接利用无机氮如氨、硝酸钠作为氮源。

在化妆品中微生物所能利用的氮源有：蛋白质、聚肽、胶朊和氨基酸。(三)无机盐这些金属元素在机体中的生理作用：有参与酶的组成、构成酶的最大活性、维持细胞结构的稳定性、调节与维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。一般微生物生长所需要的无机盐有硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。重金属元素（微生物生长所需要的微量元素），一定要控制在正常的浓度范围内。(四)生长因子某些微生物不能从普通的碳源、氮源物质合成，而需要另外加入少量的才能满足机体生长需要的有机物质。这种有机物质叫做生长因子。根据生长因子的化学结构与它们在机体内的生理作用，可以说生长因子的本质是维生素，许多维生素都能起生长因子的作用，它们中的大部分是构成酶的辅基或辅酶，它们是酶活性所需要的成分。微生物不同所需要的生长因子也不同。(五)水水在机体中的生理作用有：

1．水是微生物细胞的重要组成部分，占生活细胞总量的90％左右。

2．机体内的一系列生理生化反应都离不开水。

3．营养物质的吸收与代谢产物的分泌都是通过水来完成的。

4．由于水的比热高，又是热的良好导体，故能有效地控制细胞内温度的变化。

微生物的生长、抑制和死亡一、自然环境中的微生物微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，细胞质的量不断增加，体积得以加大，其表现即为细胞的生长。

微生物是自然界中分布最广的一群生物，无论是在高山、陆地、淡水、海洋、空气以及动植物体内外，都有它们的存在，这是微生物的重要特性之一，而这是由于微生物形体微小，易于传播；以及因微生物营养类型多，适应能力强，故可在各种不同的环境中生长。土壤＞水＞空气二、影响微生物生长和死亡的因素在化妆品的生产、保存及使用时，应制订增进或降低、甚至完全破坏微生物生命活动的有效措施。1.防腐：它是一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长、繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品、化妆品和其他物质发生腐败霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。(例)2.消毒：

是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。如将物体煮沸(100℃)10分钟或60～70℃加热处理30分钟，就可杀死病原菌的营养体，但绝非杀死所有的芽孢。还有利用某些化学制剂进行消毒。(例)3.灭菌：是指用物理或化学因素，使存在于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施，通过灭菌的物品，不再存在任何有生命的有机体。影响微生物的因素有：温度、PH、干燥、氧化还原电位(Φ)、辐射、渗透压、超声波、有机化合物、卤族元素及其化合物、表面活性剂第二章化妆品与微生物影响化妆品质量的原因很多，但受微生物污染而使其变质是非常普遍的一个严重问题。因微生物的广泛存在，它无处不有，无处不藏，在化妆品的生产、运输、贮存及使用过程中，化妆品都极易遭到微生物的污染。因而防止和消除微生物对化妆品的污染，在化妆品的研究及生产中是一个很受重视的问题。一、化妆品中的主要微生物在化妆品中存在的微生物其影响大的主要是致病菌，它们是病源细菌和致病真菌。(一)病源细菌1．革兰氏阳性菌

(1)葡萄球菌。（感染）金黄色葡萄球菌→生疖子、化脓性炎症，眼部引起麦粒肿、结膜炎等炎症。(2)链球菌→急性咽喉炎、风湿热与急性肾炎等病症。(3)双球菌：肺炎双球菌→肺炎、脑膜炎、腹膜炎和结膜炎。(4)芽孢杆菌→食物中毒症;炭疽杆菌→炭疽病。(5)梭状芽孢杆菌:破伤风梭状杆菌→破伤风。(6)棒状杆菌:白喉棒状杆菌→白喉病。

2．革兰氏阴性菌(1)奈瑟氏菌:脑膜炎奈瑟氏菌→脑膜炎，而淋病奈瑟氏菌→淋病。(2)假单孢菌:绿脓杆菌→使烧伤病人感染(该菌还可引起肺炎)。(3)沙门氏菌:沙门氏伤(副伤)寒杆菌→伤(副伤)寒。(4)弧菌:霍乱弧菌→霍乱病。(5)嗜血杆菌:流感嗜血杆菌→流感、小儿脑膜炎、慢性支气管炎。(6)埃希氏杆菌:大肠杆菌→引起腹泻、肾盂、肾炎和膀胱炎。是检验化妆品的一个重要生物指标。(7)志贺氏杆菌：志贺氏痢疾杆菌→菌痢疾。(8)分枝杆菌：结核杆菌→结核病；麻疯分枝杆菌→麻疯病。3．螺旋体螺旋体和螺菌不同，它是介于细菌与原生动物(原虫)之间的单细胞原核生物，它具有特殊的形状、结构和运动方式，用普通染色方法不易着色，用显微镜可以看见。(1)色幼氏螺旋体、回归热螺旋体→回归热病；文森氏螺旋体→咽炎和牙龈溃疡。(2)钩端螺旋体：黄疸型出血性钩端螺旋体→黄疸病。(3)密螺旋体、梅毒螺旋体→梅毒病。病源细菌:革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌螺旋体(二)致病真菌在化妆品中能引起致病的真菌有：1．表皮癣菌→皮肤生癣。2．白色念球菌→它可以进入人体呼吸道、胃肠道粘膜，引起感染。3．新型隐球菌→（是一种酵母杆菌）脑膜炎。此外，真菌也可以引起过敏性反应，其作用与灰尘和花粉所引起的过敏反应是相似的。在化妆品中对这四种致病菌：金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；绿脓杆菌和沙门氏菌特别注重，要进行专门的检测。另化妆品受到霉菌的污染，常见的霉菌为青霉、曲霉、根霉、毛霉等。二、化妆品中微生物的污染及抑制和杀灭(一)化妆品的微生物污染1、化妆品中微生物生长？油脂、胶质、蛋白质等、水分、温度、湿度－→

微生物生长繁殖。2、化妆品中微生物生长繁殖的结果？微生物吸收和分解了化妆品中的有效成分、排泄而产生了一些新的物质－→化妆品成分被破坏－→发霉、腐败－→变色、臭味、毒素－→使消费者遭到细菌感染和引起过敏等许多严重的危害

3、化妆品的微生物污染

分为两种情形一级污染：化妆品生产过程中受到的微生物污染。（设备、原料、生产及包装）二级污染：消费者使用化妆品过程中受到的污染。（使用、涂沫、盖、防腐剂）（1）生产设备：如各种输送泵、研磨机、混拌机、乳化机、装灌机等设备是微生物积聚之处，故需要进行消毒、杀菌等处理。（2）原料：如蛋白质、淀粉等原料及水（3）生产：在化妆品的生产制造过程如制造乳剂时，通常采用加热灭菌法，将水加热至90℃维持20分钟灭菌，然后与相似温度的油相进行乳化。（4）包装：在包装室要求空气净化，无菌车间。包装容器瓶、罐、管等在化妆品的包装过程中，操作工人的人体和衣物也会受到微生物的严重污染，如人体的头皮上的微生物可高达140万个／cm2，因此，必须对操作人员要求高标准的个人卫生，对所穿衣、帽、鞋等也都要进行消毒处理。

(二)化妆品的消毒与灭菌由于化妆品受到微生物的一级污染，故必须对原料、设备、成品、包装材料、容器用具以及操作环境等进行消毒和灭菌。通常使用的方法有热力、紫外线及化学药剂等。1．热力灭菌(消毒)法

(1)火焰灭菌法：酒精火焰3次每次数秒钟。(2)干热灭菌法：电烘箱160～170℃1小时；(3)高压蒸汽灭菌：利用高压水蒸汽

(4)常压蒸汽灭菌：灭菌时间40～60分钟。

2．紫外线灭菌(消毒)法紫外线中265nm波长段具有最强的杀菌作用。（1）紫外线对室内空气消毒，注意紫外线辐射对人体有影响。（2）紫外线可以杀死水中的微生物，常用的方法是在紫外光管加一玻璃套管，将要处理的水从紫外管与玻璃管之间流过，一般30W的紫外光管，水的流速为250～500毫升／分，这样可杀死水中的大肠杆菌，（3）包装物及器皿用紫外线消毒，是将所要处理的物件放于紫外光管下10cm处，照射10～15分钟，需两面照射。由于紫外线的穿透力较差，对于要求杀菌高的情况，就需用其它穿透力较强的辐射光如γ-射线，钴-辐射等来进行杀菌处理。3．化学方法的灭菌消毒化学制剂对微生物的作用有杀菌、抑菌、抗菌、防腐等。化学制剂的消毒方式可分为液相方式与气相方式两种。液相方式涂抹、浸泡或喷洒，如通常室内地面、墙面、衣物、用具进行消毒多采用这种方式；气相方式熏蒸等方式进行灭菌和消毒，这种方式使化学药物直接作用于微生物，其作用强且迅速。常用的化学制剂消毒剂有乙醇、甲酚、甲醛等制剂。(三)化妆品的防腐对于化妆品的微生物二次污染的消除，其主要手段是在化妆品中加入防腐剂，防止化妆品腐败变质。防腐剂主要是化学制剂。1．防腐剂对微生物的作用机理防腐剂对微生物的作用在于它能选择性地作用于微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死，但对人体细胞无害。(1)抑制微生物细胞壁的形成(2)影响细胞膜的功能。(3)抑制蛋白质合成和致使蛋白质变性。2．防腐剂的选择化妆品的理想防腐剂其性能应具有：(1)具有广谱的抗菌活性(2)良好的配伍性(3)良好的安全性。无毒性的，无过敏性和对皮肤无刺激的，即防腐剂在使用浓度下保证对消费者是安全的。(4)具有良好的水溶性(5)对温度和酸、碱(pH值)应是稳定的。(6)防腐剂在使用浓度下，应是无色、无臭、无味。(7)防腐剂应是较容易制得且价格低廉的。？1、紫外灯？2、化妆品中加入的防腐剂主要有那些？3、设备消毒方法？4、化妆品厂常检微生物有那些？5、原料消毒方法有那些？6、美白祛斑凯松、咪唑烷基脲系列、尼泊金系列（油系）新洁尔灭液

！

身体

微生物学

工作第三章化妆品卫生标准中华人民共和国国家标准化妆品卫生标准GB7916—87

1总则

1．1为向广大消费者提供符合卫生要求的化妆品，确保化妆品的卫生质量和使用安全，加强化妆品的卫生监督管理，保障人民身体健康，特制定本标准。

1．2化妆品系指涂、擦、散布于人体表面任何部位(如表皮、毛发、指甲、口唇等)或口腔粘膜，以达到清洁、护肤、美容和修饰目的的产品。

1．3在国内从事化妆品生产、销售都必须遵守本标准。进口化妆品也必须符合本标准的规定。

1．4地、市以上(含地、市)卫生防疫部门负责对辖区内的化妆品生产实行卫生监督；县以上(含县)卫生防疫部门负责对所辖区内的化妆品销售实行卫生监督。2化妆品卫生标准

2．1一般要求

2．1．1化妆品必须外观良好，不得有异臭。

2．1．2化妆品不得对皮肤和粘膜产生刺激和损伤作用。

2．1．3化妆品必须无感染性，使用安全。2．2对原料的要求

2．2．1禁止使用表2中所列物质为化妆品组分。

2．2．2凡以表3至表6中所列物质为化妆品组分的，必须符合表中所作规定。

2．2．3凡使用两种以上表3至表6中所列物质为化妆品组分时，必须符合如下规定：具有同类作用的物质，其用量与表中规定限量之比的总和不得大于1。2．3对产品的要求

2．3．1

化妆品的微生物学质量应符合下述规定：

2．3．1．1

眼部、口唇、口腔粘膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品细菌总数不得大于500个／m1或500个／g。

2．3．1．2

其他化妆品细菌总数不得大于1000个／m1或1000个／g。

2．3．1．3

每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。

2．3．2化妆品中所含有毒物质不得超过表1中规定的限量。表1化妆品中有毒物质限量有毒物质限量ppm备注汞铅(以铅计)砷(以砷计)甲醇140100.2％含有机汞防腐剂的眼部化妆品除外(见表4)含乙酸铅的染发剂除外(见表6)2．4

化妆品包装材料必须无毒和清洁。2．5

化妆品标签上应用中文注明产品名称、生产企业、产地，包装上要注明批号。对含药物化妆品或可能引起不良反应的化妆品尚需注明使用方法和注意事项。

2．6

对演员化妆品的某些特殊要求另订。3化妆品的卫生检验和监督

3．1

对化妆品卫生指标的检验按(GB7917．1～7917．4—87)《化妆品卫生化学标准检验方法)和

(GB7918．1～7918．5—87)／：

化妆品微生物标准检验方法》进行。3．2

对化妆品原料和产品的安全性评价按GB7919—87《化妆品安全性评价程序和方法》进行。3．3

化妆品监督部门有权派员到所辖区化妆品生产厂检查生产过程的卫生情况以及抽样检查产品的卫生质量。3．4

监督人员抽检的样品，必须立即贴上封条，并贴标签注明采样地点、日期、采样人和其他有关事项。3．5

监督部门应有计划地对化妆品生产和销售的卫生管理和产品的安全卫生问题进行不定期的检查。第四章

化妆品微生物标准检验方法中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法总则

GB7918．1—871样品的采集及注意事项

1．1

所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10ml。包装量小的样品，取样量可酌减。

1．2

供检样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得启开，以防再污染。

1．3

接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。

1．4

若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品作细菌检验，再将剩余样品作其他分析。

1．5

在检验过程中，从开封到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行。或在相应条件下，按无菌操作规定进行。

1．6

如检出粪大肠菌群或其他致病菌，自报告发出起该菌种及被检样品应保存一个月备查。述2供检样品的制备

2．1培养基和试剂生理盐水、SCDLP液体培养基2．2仪器2．3不同类型样品的检样制备（制成1：10稀释液）2．3．1液体样品2．3．1．1

水溶性的液体样品，可量取10ml加到90ml灭菌生理盐水中，如样品少于10ml。仍按10倍稀释法进行。如为5ml则加45ml灭菌生理盐水，混匀后，制成1：10稀释液。

2．3．1.2油性液体。取样品10ml，先加5ml灭菌液体石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40～44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75ml(在40～44℃水浴中预温)，在40～44℃水浴中乳化，制成l：10的悬液。

2．3．2膏、霜、乳剂半固体状样品2．3．2．1亲水性的样品，称取10g，加到灭菌的带玻璃珠加有90ml灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡混匀，放32℃水浴静置15min。用其上清液作为1：10的稀释液。

2．3．2．2疏水性的样品，称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40~44℃水浴中充分混合，制成1：10稀释液。

2．3．2．3固体样品，称取10g，加到灭菌的生理盐水稀释瓶中，振荡混匀，使其分散混悬后，放30～32℃水浴中，15min后取出，充分振荡混合，再放到30～32℃水浴中静置15min，取上清液作为1，10的稀释液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加90ml灭菌生理盐水，均质1～2min。

疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品加90mlCDLP液体培养基，或1g样品加1ml灭菌液体石蜡、1ml灭菌吐温80、7ml灭菌生理盐水，均质3～5min。化妆品微生物标准检验方法

细菌总数测定

GB7918．2—87

细菌总数系指lg或1ml化妆品中所含的活菌数量。测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。

本标准采用标准平板计数法。标准平板培养计数法

(一)设备和材料冰箱、恒温水浴、天平、电炉、吸管、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿（培养皿、二重皿）、试管、酒精灯、均质器或乳钵、试管架、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、酒精棉球、玻璃蜡笔、恒温培养箱、放大镜等。(二)培养基和试剂

营养琼脂培养基、75％乙醇、生理盐水或其他稀释液。(三)菌落总数的检验程序

(四)操作步骤

1．检样稀释及培养(1)以无菌操作，将检样１０g(或１０mL)剪碎放于含有９０mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：1０的均匀稀释液。(2)用1mL灭菌吸管吸取1:1０稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管混合均匀，做成1:1００的稀释液。(3)另取1mL灭菌吸管，做1０倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。(4)根据产品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做1０倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。(5)稀释液移入平皿后，应及时将晾至46℃营养琼脂培养基(可放置46℃±1C水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾人加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内做空白对照。(6)待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃培养箱内培养48h取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)样品所含菌落总数。2．菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜(5~10倍)检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。3．菌落计数的报告

(1)平板菌落数的选择。选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。(2)稀释度的选择：a．应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表例1)。b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表例2及例3)。c．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例4)。d.

若所有稀释度的平均菌落数小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例5)。e．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于(<)1乘以最低稀释倍数报告之(见表例6)。f．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例7)。g.若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。(3)菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数据报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(五)注意事项

(1)检验中所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，(2)用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。(3)检佯的稀释液可用灭菌盐水或其他稀释液进行稀释。(4)注意每递增稀释一次，必须另换一支lmL灭菌吸管等.思考：样品中细菌总数的检验选择1∶1000，1∶10000稀释度

1、准备玻璃器皿洗净二重皿5套，三角瓶二个，试管3支，1ml的移液管4支、10ml的移液管1支及200ml的容量瓶。2、包扎培养皿用纸包好；3支试管装水9ml塞好棉塞并用纸包好；其中一三角瓶装水225ml，并放入玻璃珠5～6粒，塞好棉塞并用纸包好；移液管用纸包好。3、制备培养基制备培养基100ml，用另一三角瓶装好，塞上棉塞，并用纸包扎好。4、灭菌：把所用玻璃器皿（10ml的移液管及200ml的容量瓶除外）和培养基进行灭菌，灭菌条件分别为160℃2小时和115℃、20分钟。5、检样稀释及培养（1）无菌操作，称10g奶粉放入装有90ml灭菌水的三角瓶内，充分摇匀得1∶10的均匀稀释液。（2）用1ml灭菌移液管吸取1∶10稀释液1ml，注入9ml灭菌水的试管内，摇匀成1：100稀释液。（3）另用一支1ml灭菌移液管，按上述操作顺序做10倍递增的稀释液，每递增稀释液一次，即换用一支移液管，制备1∶1000；1∶10000稀释液。（4）选择1∶1000，1∶10000稀释度各以1ml之量加入灭菌平皿中；接着立即倒入约15ml培养基于平皿中摇匀，另取一空白平皿倒入培养基作空白对照。（5）培养基凝固后，翻转平皿于37℃恒温箱内培养48小时。6、菌落计数及报告化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群GB7918．3一87（28）化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌GB7918．5—87化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌OB7918．4—87无菌室无菌程度的测定一般采用平板法。

(1)将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒人已灭过菌的培养皿内，每皿约15mL培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，l0min后，盖好皿盖。

(2)将培养皿倒置于37C培养24h后，观察菌落情况，统计菌落数。

(3)如果每个皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，再重复以上步骤。1、高压蒸汽灭菌使用高压蒸汽灭菌锅时：①必须将灭菌锅内的冷空气完全排除，才能达到预期的真实温度，否则会造成假象而灭菌不彻底。②待灭菌的物质在锅内不要放得太挤，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果。③灭菌完毕应缓慢减压，至压力表为“零”时再打开锅盖，否则蒸汽外溢会造成烫伤，瓶内的液体也会突然沸腾，将棉花塞顶出或弄湿。2、显微镜的结构与使用

①结构：显微镜的结构包括机械部分与光学部分。机械部分：镜筒、镜座、回转盘、倾斜关节、调节螺旋、载物台和光圈。光学部分：目镜、接物镜、集光器和反光镜。显微镜的性能取决于物镜的分辨率，分辨率是根据区分开物体上两点之间的最小距离决定的，因此，显微镜对物体的放大倍数是目镜放大倍数与物镜放大倍数的积。分辨率愈高的显微镜性能愈好。②使用：将显微镜置于平稳的实验台上，镜检者坐姿要端正，一般以左眼观察，右眼绘图。光线应避免直射阳光。反光镜有凹平两面，在光线较强的天然光源，宜用平面镜，光线较弱的光源或人工光源，宜用凹面镜。3、染色技术细菌染色法有单染色法和复染色法两种。革兰氏染色属于复染色法。具体操作：①涂片基本步骤：涂片一干燥一固定。②革兰氏染色步骤：滴加革兰氏染色第一液(结晶紫)染色1分钟，水洗；滴加第二液(碘液)作用1分钟，水洗；滴加第三液(95％乙醇)脱色0.5~1分钟，水洗；滴加第四液(碳酸复红)复染0.5分钟、水洗、干燥。镜检：革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。培养基的分装摆斜面或倒平板