食用菌选修课

第二章菌种制作技术

第一节制种的程序第二节

食用菌的菌种制作技术

第三节

消毒灭菌方法

第四节母种的别离培养第五节

菌种质量的鉴定和保藏第六节

菌种制备过程中的几个问题第七节

菌种生产的季节安排一、制种的程序

1.种菇的选择及孢子的采集第一节制种的程序2.菌种别离3.母种培养4.原种的培养5.栽培种的培养第二节

食用菌的菌种制作技术

一、母种的制作1.母种的概念：又称一级种，是指由孢子别离、菇木别离或组织别离所得到的试管种。2.母种培养基的种类〔1〕土豆：200g，糖20g，琼脂20g；水1000mL。〔2〕蛋白胨2g；糖20g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g；水：1000mL。适用于多种食用菌。〔3〕玉米粉40g，糖10g，琼脂20g；水1000mL。3.母种培养基的配制

〔1〕按配方称药品〔2〕融化、过滤〔3〕装试管：试管规格为18×180mm，装量为管长的1∕5，擦净管口、塞松紧度适宜的棉塞。〔4〕灭菌：121℃，30min〔5〕摆斜面：趁热摆斜面，为管长的1/2~3/5。4.接种〔1〕菌种外表消毒；〔2〕将菌种切割成2×4×2mm的小块；〔3〕将菌种接到斜面中心略偏试管底部处；〔4〕1支试管种可接斜面30支左右。5.培养〔1〕最适培养温度多数食用菌为25℃，木耳、银耳28℃，草菇35℃。〔2〕培养时间不同的菌种差异较大，一般为7~12天。〔3〕协调的最适培养温度比最适培养温度低2~3℃，菌丝健壮。二、原种的制作1.原种的概念将母种接入瓶装或袋装的木屑、麦粒或粪草等培养基内所得到的菌种。2.原种培养基的种类

〔1〕木屑78%，麦麸20%，糖1%，石膏1%。〔2〕棉籽壳88%，麦麸10%，糖1%，石膏1%。〔3〕麦草50%，牛粪46.%，糖1%，石膏1%，过磷酸钙1.5%，尿素0.5%。3.原种的配制〔1〕过筛、称重〔2〕浸泡或直接拌料〔3〕装瓶或袋松紧适宜、打孔、擦净塑料袋规格：17×33cm瓶规格：菌种瓶、罐头瓶。装袋高压蒸汽灭菌锅：121℃,2~2.5小时；土蒸锅：100℃，10小时。〔4〕灭菌4.接种〔1〕菌种外表消毒；〔2〕将菌种斜面分成5等份；〔3〕将菌种接到瓶或袋装培养基的顶部中心处；〔4〕1支试管种可接原种培养基5瓶〔袋〕左右。5.培养〔1〕最适培养温度多数食用菌为25℃，木耳、银耳28℃，草菇35℃。〔2〕培养时间不同的菌种差异较大，一般为28~42天。三、栽培种的制作1.栽培种的概念将原种接入瓶装或袋装的木屑、麦粒或粪草等培养基内所得到的菌种。

2.装袋、灭菌与原种相同3.接种〔1〕菌种外表消毒；〔2〕将菌种分成花生米或蚕豆大小的小块；〔3〕将菌种接到袋装培养基的两侧；〔4〕1瓶原种可接栽培种培养基30袋(两头接种)左右。4.培养与原种相同第三节

消毒灭菌方法

一、物理方法消毒灭菌1.高压蒸气灭菌

〔1〕排汽要彻底；〔2〕物体摆放要均匀；〔3〕棉塞要防潮；〔4〕灭菌时间物品的多少而定；〔5〕翻开灭菌锅前要缓放汽。2.常压蒸气灭菌〔1〕灭菌温度为100℃；〔2〕灭菌时间10小时左右；3.间歇蒸气灭菌100℃灭菌1小时→间歇1天→100℃灭菌1小时→间歇1天→100℃灭菌1小时。4.干热灭菌适合于瓶、试管口和接种工具。

5.紫外线〔1〕适合于空气和物体外表消毒；〔2〕照射距离以1.2米最好，2米有效；〔3〕照射时间以20~30min；〔4〕照射环境应黑暗。二、化学方法消毒灭菌1.酒精〔1〕浓度：70~75%〔2〕用于皮肤和器具外表消毒。2.甲醛〔1〕浓度：10mL/立方米；〔2〕用于空气和物体外表消毒。3.高锰酸钾〔1〕浓度：0.1%；〔2〕用于物体外表消毒。4.升汞〔HgCl2〕〔1〕浓度：0.1%；〔2〕用于非金属器皿消毒。5.来苏尔〔1〕浓度：1~3%；〔2〕操作人员的手、器皿和接种室喷雾消毒。6.生石灰〔1〕浓度：2~3%；〔2〕通过提高pH抑制杂菌生长。7.多菌灵〔1〕浓度：0.1%；〔2〕用于拌料〔生料栽培〕，遇碱失效。8.菇保1号袋包粉末，接种前燃烧消毒第四节母种的别离培养食用菌生产用的种子是菌丝体，不用孢子；菌种质量的优劣影响产量和质量。在自然界里，食用菌不是单独存在的，而是和许多细菌、放线菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种别离，就是把食用菌从这些和食用菌一起生活的杂菌中别离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。食用菌母种的别离，可分为孢子别离法、组织别离法以及基内菌丝别离等。一、孢子别离法是用食用菌的孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能用于生产。1.种菇的选择选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇。2.种菇的消毒去菌柄，无菌水冲洗数次，移到超净工作台，用无菌纱布或脱脂棉、滤纸吸干外表水分。3.孢子的采集4.稀释、接种〔接种环或注射针头〕单孢别离法多孢别离法——孢子印法多孢别离法——钩悬法多孢别离法——褶上涂抹法5.培养6.转管25℃，恒温培养。待菌丝长至1cm，转管。培养7~10天。1.种菇的选择和消毒；2.用手术刀将菌柄与菌盖交界处的组织切成大米粒大小的小块；3.接种将组织块接到斜面中心略偏试管底部处；4.培养5.转管二、组织别离法1.菇木的采集2.菇木的消毒并去掉树皮3.将菇木切成大米粒大小的小块4.将菇木小块接到斜面中心略偏试管底部处；5.培养25℃，恒温培养。6.转管待菌丝长至1cm，转管。培养7~10天。三、菇木别离法土中菌丝别离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌；孢子不易萌发。组织别离也不易成功，用土中菌丝别离获得纯种的方法，叫土中菌丝别离。

由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此别离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中参加一些抑制细菌生长的药物，如40微克／升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。子实体基局部离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基局部离出新菌丝的方法，叫子实体基局部离，以袋栽银耳为例说明：从出耳早、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为别离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针，塞上棉塞。为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。别离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木别离得快。经2-3天后，别离物的边缘就可看到白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木别离法担同。经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。第五节

菌种质量的鉴定和保藏〔1〕镜检；〔2〕PDA培养基试验；〔3〕高温试验〔35℃半天〕；〔4〕菌丝生长观察〔速度、密度〕；〔5〕吃料观察；〔6〕产量试验及子实体质量观察。一、菌种质量的鉴定1.母种质量的鉴定2.原种和栽培种的质量要求〔1〕用转管5次以内的母种生产原种和栽培种；〔2〕室温下3个月的菌令；〔举例：老化菌种〕；〔3〕菌丝洁白、健壮、绒毛菌丝多；〔4〕无杂菌污染；〔5〕无黄水渗出。二、菌种的保藏1.传代培养保藏法〔1〕斜面法——根本方法①菌种转接到适宜斜面上〔最好用带帽的螺旋试管〕；②适温培养至菌体健壮；③用油纸包扎好棉塞局部，4℃冰箱保藏；④定期转管。特点：①简单易行，能随时观察，适宜短期保藏的菌种；②保藏时间短，一般为2~4个月，需定期传代培养，容易污染，菌种易退化。

〔2〕液体石蜡法长好斜面的菌种→加无菌液体石蜡→盖试管帽→直立4℃冰箱保藏。特点：①保藏时间一般为1~2年，不须经常转接；②缺点是需直立，占空间大，不变于携带。

2.冷冻保藏法

将菌种处于冷冻状态，使其代谢作用停止，理论上新陈代谢停止是-130℃，可无限期保藏。低温会使细胞内的水分形成冰晶，速冻冰晶小而减小对细胞的损伤；快速升温，可减少对细胞的损伤。〔1〕原理：〔2〕冷冻保护剂保护剂可提高存活率，如：甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、脱脂牛奶等。①液氮保藏法：-196℃

，需使用专用器具，适合专业保藏，理想的保藏方法；

②-70℃低温冰箱保藏法

③-20℃~-30℃普通冰箱保藏法三、菌种的复壮复壮是从衰退的群体中找出少数尚无衰退的个体。1.淘汰已衰退的个体将斜面菌丝制成菌悬液→用注射器接种于平板中→适温培养至菌丝萌发→挑选健壮菌丝转接→经试验符合原菌种形状→用于生产2.定期重新别离菌种一般1~2年后重新别离一次，可采用组织别离法或菇木别离法一、组织别离法别离母种时，组织块不萌发的原因1.消毒过头2.烫死3.挫折4.污染5.种菇有病第六节

菌种制备过程中的几个问题二、母种接原种时，母种不萌发的原因

1.消毒过头2.烫死3.挫折4.污染5.母种老化接种块没有贴紧培养基2.培养基含水量太低pH不适宜4.培养基配方不合理5.恒温器控制失灵三、制原种和栽培种时，接种块不萌发后不吃料的原因四、菌种污染的原因1.杂菌出现在中下部或全瓶〔袋〕——灭菌不彻底2.瓶〔袋〕壁上某处出现杂菌——瓶〔袋〕有裂口3.接种块上发生污染

——菌种本身带菌或接种工具消毒不彻底4.瓶〔袋〕接种穴外表出现杂菌——接种操作不严第七节

菌种生产的季节安排一、母种的活化新购置或冰箱保藏的菌种必须活化。所谓活化，是指将菌种重新转接，在适宜的温度下培养，当菌丝长满斜面，即得到活化菌种一般需要10~15天。二、母种的扩接

根据生产需要，按排接种时间和支数。

不同的食用菌从接种到满管所需要的天数：