醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白学号：200900140157班级：09生科3班姓名：俞华军时间：2011/03/27一．实验目的1.掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。2.掌握电泳仪的使用方法。二．实验原理蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极定向移动，在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中想阳极移动。血清中含有书中蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH值得溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中的移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见表一），在电场中迁移速度不同，由表一可知，血清中5中蛋白质的等电点大部分低于pH7.0，所以在缓冲液（pH8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。表一人体血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量/Mr白蛋白4.8869000α1—球蛋白5.06200000α2—球蛋白5.06300000β—球蛋白5.1290000—150000γ—球蛋白6.85—7.50156000—300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L的氢氧化钠溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使血清中蛋白含量下降，肾病时α1、α2、β—球蛋白升高，γ—球蛋白降低。肝硬化时α2、β—球蛋白降低，而α1、γ—球蛋白升高。所以，可以测定人体血清中蛋白含量的值来诊断一些疾病。三．实验器材试剂：巴比妥—巴比妥钠缓冲液、95%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、染色液用品：醋酸纤维薄膜（x2）、人血清、培养皿（x3）、载玻片、盖玻片、电吹风、吸管5ml（x1）、2ml（x2）、直流稳压电泳仪、电泳槽、镊子、滤纸、烧杯100ml（x2）、锥形瓶300ml（x2）四．实验步骤1.薄膜浸泡选择可用的醋酸纤维薄膜（2cmx8cm）两条，浸于缓冲液中30min以上；2.电泳仪准备连接号电泳仪的线路，检查电路是否可用，检查完毕后往电泳槽中导入电解液，即巴比妥—巴比妥钠缓冲液；3.点样（1）将浸泡30min以上的醋酸纤维薄膜弄镊子轻轻取出，将薄膜一面平放在干净滤纸上，几秒后，把薄膜翻过来，把另一面平放在滤纸上，吸去多余的缓冲液，吸完后把薄膜平放于干净的玻璃上，准备点样；（2）取几滴人血清样品于载玻片上，根据薄膜大小裁剪盖玻片大小，然后用盖玻片轻轻蘸取血清样品，然后轻轻与薄一端1.5cm处接触，待薄膜上有一条清晰的血清痕迹即可点样结束；4.电泳（1）用镊子夹住薄膜两端，并把薄膜拉直，轻轻放到电极桥上，点样端为阴极，并用镊子压薄膜与电极桥接触的两端，使其接触紧密；（2）平衡10min后打开电源，调至90V，预电泳10min，随后再把电压调至110V，电泳50min—1h；5.染色电泳完毕后，将薄膜浸于染色液中9min—10min6.漂洗（1）配制漂洗液：45ml95%乙醇+5ml冰乙酸+50ml蒸馏水；（2）把染色完后的薄膜弄镊子取出，用漂洗液漂洗至背景为灰蓝色（大概3—4次），漂洗结束后把薄膜贴于干净的玻璃上，用吹风机吹干。7.透明和取带（1）配制透明液：以无水乙醇：冰乙酸=7:3的比例配20ml；（2）薄膜用吹风机吹干后，浸入透明液中，值背景为透明为止，大概10min左右，取出薄膜并贴于干净玻璃上，用吹风机吹干后轻轻从薄膜上揭下蛋白质带。五．实验结果记录与处理六．实验分析1.薄膜浸泡必须30min以上，否则会影响电泳效果，取出薄膜吸取过多的缓冲液时，要注意不能长久放置于滤纸上，这样会使渗透于薄膜内的缓冲液被吸出来，使电泳时蛋白质不能完全分开，影响最后结果，而本次实验中，蛋白质区带区分并不明显，可能与此有关。2.连接电泳仪线路时要注意正负极，用前检查电泳仪是否可用，在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零，否则一打开电源，瞬间电压过高会烧坏仪器。3.在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线，且电极槽液面要保持一致，同时要漫过电桥，否则无法形成回路，不能进行电泳。4.点样时要注意只需轻轻的点一下即可，有一条清晰的血清痕迹即可，且要注意不要距端口太近，而如果重复点样，重复点样会导致电泳结果不清晰，条带混杂，本次实验部分条带出现这种情况，可能是这个原因。5.在把薄膜放到电桥上时，要注意点样区不能接触到电桥上的滤纸，且点样区放在阴极端，还有，薄膜必须要拉直，中间部分不能与电解槽接触。6.配制漂洗液、透明液利用冰乙酸时要注意不能接触到手、皮肤或衣物，因为冰乙酸有强烈的腐蚀性，同时也要注意不可闻其气味，因为冰乙酸气味及其浓烈，对鼻黏膜有损害；染色液用完要注意回收。7.漂洗时要注意时间产度，背景色变为灰蓝色即可，过度漂洗会使蛋白质条带也被洗掉，影响最后实验的结果。8.进行透明时也要注意时间长度，时间过长也会引起蛋白