酶工程全套课件

酶的分離純化3.1酶的提取、分離純化技術路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發酵液離心分離，過濾分離，沉澱分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等。酶的純化過程，約可分為三個階段：(1)粗蛋白質

(crudeprotein):採樣

→均質打破細胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質酶

(homogeneous):目標酶的進一步精製純化，可用製備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段本章目錄3.2細胞破碎許多酶存在於細胞內。為了提取這些胞內酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶製劑法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶製劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理本章目錄酶的提取是指在一定的條件下，用適當的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應根據酶的結構和溶解性質，選擇適當的溶劑。一般說來，極性物質易溶於極性溶劑中，非極性物質易溶於非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶於鹼性溶劑中，鹼性物質易溶於酸性溶劑中。酶都能溶解於水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。3.3酶的提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利於提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率並防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用於提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用於提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用於提取在稀堿溶液中溶解度大且穩定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用於提取那些與脂質結合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數蛋白類酶都溶於水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現象。本章目錄3.4酶的分離方法1、沉澱分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go本章目錄1、沉澱分離沉澱分離是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉澱析出，與其它溶質分離的技術過程。沉澱分離方法分離原理

鹽析沉澱法利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉澱，從而使酶與雜質分離等電點沉澱法利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節溶液的pH值，使酶或雜質沉澱析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉澱法利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉澱析出，從而使酶與雜質分離複合沉澱法在酶液中加入某些物質，使它與酶形成複合物而沉澱下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉澱法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉澱，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離在鹽濃度達到某一界限後，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現象。

在一定的溫度和pH值條件下（β為常數），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質分離的方法，稱為β分段鹽析。

在蛋白質的鹽析中，通常採用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由於硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度係數小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩衝能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質的測定，所以有時也用其他中性鹽進行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。有機溶劑之所以能使酶沉澱析出。主要是由於有機溶劑的存在會使溶液的介電常數降低。例如，20℃時水的介電常數為80，而82％乙醇水溶液的介電常數為40。溶液的介電常數降低，就使溶質分子間的靜電引力增大，互相吸引而易於凝集，同時，對於具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉澱析出。

常用於酶的沉澱分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等本節目錄2、離心分離

離心分離是借助於離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、不同密度的物質分離的技術過程。在離心分離時，要根據欲分離物質以及雜質的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉速在8000r/min以內，相對離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用於細胞、細胞碎片和培養基殘渣等固形物的分離。也用於酶的結晶等較大顆粒的分離。高速離心機的最大轉速為（1～2.5）×104r/min，相對離心力達到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用於沉澱、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心主要用於DNA、RNA、蛋白質等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降係數和相對分子品質的測定等。超速離心機按照其用途可以分為製備用超速離心機、分析用超速離心機和分析-製備兩用超速離心機3種蛋白質分子在離心時，其分子量、分子密度、組成、形狀

等，均會影響其沉降速率，沉降係係數即用來描述此沉降性質；其單位為

S(Svedbergunit)。每一種的沉降係數與其分子密度或分子量成正比。不同沉降係數的蛋白質，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。本節目錄3、過濾與膜分離過濾是借助於過濾介質將不同大小、不同形狀的物質分離的技術過程。過濾介質多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結金屬和各種高分子膜等，可以根據需要選用。過濾非膜過濾：採用高分子膜以外的物質作為過濾介質膜過濾：採用各種高分子膜為過濾介質過濾的分類及其特性(根據過濾介質截留的物質顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質過濾介質粗濾>2μm酵母、黴菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20Å生物小分子、鹽、離子反滲透膜

借助於一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質顆粒或分子進行分離的技術稱為膜分離技術。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物製成的高分子膜。有時也可以採用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小於其孔徑的物質顆粒或分子通過，而把大於其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規格可供使用時選擇。膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴散膜分離透析根據膜材料和不同進料液的特性，商品應用的膜產品通常採取如下幾種結構形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。膜技術截留物尺寸nm（分子量）推動力分離機理微濾MF>20(>40,000)壓力差，>100kPa篩分超濾UF1～20(10,000--40,000)壓力差，>100kPa篩分納濾NF>1(100～1000)壓力差，<1000kPa優先吸附、表面電位反滲透RO(>100)壓力差，>1000kPa優先吸附、溶解擴散四種常用膜分離技術的基本特徵四種常用膜分離過程的截留特性本節目錄4、層析分離層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同程度分佈在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)並使各組分以不同速度移動，從而達到分離。層析分離方法

層析方法分離依據吸附層析利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配係數不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子品質不同而達到物質分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現組分分離吸附層析是利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡單。吸附層析通常採用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱後，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內不斷發生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配係數不同，而使各組分分離的方法。分配係數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定後，層析係數是一常數。在分配層析中，通常採用一種多孔性固體支持物（如濾紙、矽藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質在流動相的帶動流經固定相時，該溶質在兩相之間進行連續的動態分配。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質。通過在不溶性高分子物質（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而製成。按活性基團的性質不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由於酶分子具有兩性性質，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子品質不同而達到物質分離的一種層析技術。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經凝膠層析柱時，大分子物質由於分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分佈於凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內，不斷地進出於一個個顆粒的微孔內外，這就使小分子物質向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子品質由大到小的順序先後流出層析柱，而達到分離的目的。常用的凝膠：

葡聚糖凝膠

瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠

聚丙烯醯胺凝膠

親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因數,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應用.親和層析的四個要素常用的親和介質及專一性配體根據欲分離組分與配基的結合特性,親和層析可以分為：

共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

疏水層析與反相層析的基本原理本節目錄5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

顆粒在電場中的移動速度主要決定於其本身所帶的淨電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。製備式電泳通常以不含SDS的原態disc

進行，以便回收具有活性的蛋白質；蛋白質樣本要先經過部分純化，否則效果不佳，並先以分析式電泳確定所要色帶的位置。本節目錄6、萃取分離萃取分離是利用物質在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可採用其他流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：

有機溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取

各種雙水相系統聚合物P

聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度流體名稱臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578本節目錄3.5酶的組合分離純化策略Resolution（解析度）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）設計分離純化工藝的基本要求本章目錄3.6酶的濃縮、乾燥與結晶濃縮與乾燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶的分離純化過程中是一個重要的環節。離心分離、過濾與膜分離、沉澱分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如矽膠、聚乙二醇、乾燥凝膠等吸去水分，也可以達到濃縮效果。蒸發濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發，使溶液得以濃縮的過程。由於酶在高溫條件下不穩定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常採用真空濃縮。即在一定的真空條件下，使酶液在60℃以下進行濃縮。在固體酶製劑的生產過程中，為了提高酶的穩定性，便於保存、運輸和使用，一般都必須進行乾燥。常用的乾燥方法有：真空乾燥冷凍乾燥噴霧乾燥氣流乾燥吸附乾燥結晶是溶質以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結晶是酶分離純化的一種手段。它不僅為酶的結構與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應用創造了條件。酶在結晶之前，酶液必須經過純化達到一定的純度。如果酶液純度太低，不能進行結晶。通常酶的純度應當在50%以上，方能進行結晶。總的趨勢是酶的純度越高，越容易進行結晶。要說明的是，不同的酶對結晶時的純度要求不同。

有些酶在純度達到50%時就可能結晶，而有些酶在純度很高的條件下也無法析出結晶。所以酶的結晶並非達到絕對純化，只是達到相當的純度而已。鹽析結晶有機溶劑結晶透析平衡結晶等電點結晶本章目錄

酶的分子修飾

4.1什麼是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結構發生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質），特別是具有生物相容性的物質，進行共價連接，從而改變酶的結構和性質。酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強酶的穩定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和瞭解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響structure

回本章目錄4.2酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的瞭解。（1）酶的穩定性熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因數等。其他如分子大小、性狀、亞基數等。酶分子修飾的條件修飾反應盡可能在酶穩定條件下進行，並儘量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態。由於它們的解離狀態不同，反應性能也不同。（2）修飾反應的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（3）反應體系中酶與修飾劑的比例

回本章目錄4.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾,大分子結合修飾(共價/非共價)側鏈基團修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾

(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-澱粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，醯基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復或者部分恢復。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態。

c.加入置換離子：於去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多餘的置換離子，就可以得到經過金屬離子置換後的酶。金屬離子置換修飾只適用於那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用於金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。

(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調節酶的微環境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質。蛋白質分子之間相互作用時，其表面區域內排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩定性也就增加了。非共價修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接於酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結合修飾採用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經過活化，然後才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性、無殘留、無免疫原性，並可消除酶的抗原性，使其末端活化後可以與酶產生交聯，因而，它被廣泛用於酶的修飾。酶

半衰期相對穩定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的側鏈基團修飾採用一定的方法（一般為化學法）使酶蛋白的側鏈基團發生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。可以用於研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經常採用。酶蛋白的側鏈基團是指組成蛋白質的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩定有重要作用。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。催化活性/非催化活性基團的修飾對非催化基團修飾可改變酶的動力學性質，改變酶對特殊底物的束縛能力。

經常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp對催化活性基團可以通過選擇性修飾側鏈成分來實現氨基酸的取代。常見基團的化學修飾反應：羧基常見基團的化學修飾反應：氨基常見基團的化學修飾反應：巰基常見基團的化學修飾反應：咪唑基常見基團的化學修飾反應：酚羥基常見基團的化學修飾反應：胍基常見基團的化學修飾反應：色氨酸吲哚基(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結構及其空間結構發生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原啟動法。a、胃蛋白酶原的啟動b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的啟動c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的啟動(5)氨基酸置換修飾氨基酸或核苷酸的置換修飾可以採用化學修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉換為半胱氨酸，修飾後，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作複雜，難以工業化生產。

現在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術。定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。是蛋白質工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術。定點突變技術，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。酶分子的定點突變1、基因序列分析2、蛋白質結構分析3、酶活性中心分析4、引物設計進行基因定點突變5、酶基因克隆表達6、變異特性分析(6)酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以瞭解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由於酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在於不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發生某些變化和重排。回本章目錄4.4酶修飾後的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因數的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩定性。半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由於酶分子經修飾後，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩定性，從而延長了在體內的半衰期。最適pH：大部分酶經化學修飾後，酶的最適pH發生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近於生理環境，在臨床應用上有較大意義。Km的變化：大多數酶經修飾後，Vm沒有明顯變化，但有些酶經修飾後，Km值變大。回本章目錄4.5酶的定向進化酶分子的合理設計(rationaldesign)酶分子的定向進化(directedevolution)酶的合理設計體外定向進化的意義理論上，蛋白質分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待於開發，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬於蛋白質的非合理設計，它不需事先瞭解酶的空間結構和催化機制，通過人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，並定向選擇出所需性質的突變酶。酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用範圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開闢了嶄新的途徑，並且正在工業、農業和醫藥等領域逐漸顯示其生命力。定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構建突變庫，憑藉定向的選擇方法，選出所需性質的優化酶(或蛋白質)，從而排除其他突變體。定向進化的基本規則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+選擇。前者是人為引發的，後者雖相當於環境，但只作用於突變後的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優化性質合為一體。外顯子改組（exonshuffling）類似於DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進行交換，前者尤其適用於真核生物。在自然界中，不同分子的內含子間發生同源重組，導致不同外顯子的結合，是產生新蛋白質的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發生在整個基因片段上。DNA改組原理定向進化的選擇策略1、定向進化中，突變具有隨機性，但通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質相關。另有一些其他的篩選方法，如加入能產生可見光信號的底物或利用綠色螢光蛋白的螢光性質等。高通量的篩選體系酶性質突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機相活性/穩定性易錯PCRβ-內醯胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN′穩定性盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機相活性易錯PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變β-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色螢光蛋白螢光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩定性隨機/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達DNA改組酶的體外定向進化應用實例回本章目錄

固定化酶和細胞

酶應用過程中的一些不足酶的穩定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-澱粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數的酶在高溫、強酸、強鹼和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統中，與底物和產物混在一起，反應結束後，即使酶仍有很高的活力，也難於回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產成本提高，而且難於連續化生產。產物的分離純化較困難：酶反應後成為雜質與產物混在一起，無疑給產物的進一步的分離純化帶來一定的困難。固定化技術5.1什麼是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術化學偶聯酶固定化間歇可溶交聯包埋吸附間歇連續酶的固定化技術和固定化酶固定化酶：經提取和分離純化後的酶固定化菌體(死細胞)：含酶菌體或菌體碎片固定化細胞：在一定的空間範圍內進行生命活動的細胞優點：不溶於水，易於與產物分離；可反復使用；可連續化生產；穩定性好。缺點： 固定化過程中往往會引起酶的失活本章目錄5.2固定化酶的研究歷史固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith採用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、澱粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結合，製成固定化酶。60年代後期，固定化技術迅速發展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業上生產應用固定化氨基醯化酶從DL-氨基酸連續生產L-氨基酸，實現了酶應用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學術會議上，確定固定化酶的統一英文名稱為Immobilizedenzyme。隨著固定化技術的發展，出現固定化菌體。1973年，日本首次在工業上應用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續生產L-天門冬氨酸。在固定化酶和固定化菌體的基礎上，70年代後期出現了固定化細胞技術。1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產澱粉酶，開始了用固定化細胞生產酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生質體生產谷氨酸，取得進展。固定化原生質體由於解除了細胞壁的障礙，更有利於胞內物質的分泌，這為胞內酶生產技術路線的變革提供了新的方向。本章目錄5.3酶固定化技術活性中心：保護酶的催化作用，並使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在製備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位於酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強鹼等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應儘量在非常溫和的條件下進行。固定化酶操作的注意事項1、吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、矽藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、矽膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。由於靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。2、包埋法

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯樹脂、聚醯胺、火棉膠等。根據載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要製成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶。常用於製備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等首先被採用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－澱粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯醯胺，丙烯醯胺，引發劑海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，並把酶或細胞分散在其中，然後將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯的離子網路凝膠。顆粒大小可即時監控脂質體包裹3、結合法

選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，第一個離子結合法固定化酶：

DEAE-Cellulose

固定化過氧化氫酶第一個工業化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基醯化酶4、交聯法借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，製成網狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的游離氨基反應，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯，製成固定化酶或固定化菌體。交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由於交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且製備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯法與吸附法或包埋法聯合使用，以取長補短。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄5.4固定化酶的特性：將酶或含酶菌體固定化製成固定化酶或固定化菌體以後，由於受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經過固定化後，其作用的最適pH值往往會發生一些變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質，另一個是酶催化反應產物的性質。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關係。固定化酶底物特異性的改變，是由於載體的空間位阻作用引起的。本章目錄乙醯-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙醯-D—AlaAminoacylase

氨基醯化酶5.5固定化酶的應用世界上第一種工業化生產的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米麯黴中提取分離得到的氨基醯化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結合法制成固定化酶，將L-乙醯氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙醯氨基酸，連續生產L-氨基酸。剩餘的D-乙醯氨基酸經過消旋化，生成DL-乙醯氨基酸，再進行拆分。生產成本僅為用游離酶生產成本的60％左右。泵儲罐反應產物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala高果糖漿的生產世界上生產規模最大的一種固定化酶。將培養好的含葡萄糖異構酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，製成固定化酶，催化葡萄糖異構化生成果糖，用於連續生產果葡糖漿。青黴素醯化酶轉化流程圖酶感測器酶感測器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當的載體結合形成的不溶於水的固定化酶膜。最常用的酶感測器是酶電極，即將固定化酶膜與轉換電極做在一起，當酶膜與被測物發生催化反應而生成電極活性物質後，電極測定活性物質並將其轉換為電信號輸出。酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先製造出酶電極並把它用於葡萄糖的定量分析。酶電極一般可根據電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，後者有NH3、CO2、H2電極等。較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極。葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極葡萄糖酶電極結構示意圖

葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯醯胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發生氧化反應，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消耗的氧或生成的過氧化氫就可瞭解葡萄糖濃度。

手掌型葡萄糖(glucose)分析儀脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產生的2NH4+為陽離子電極感應。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青黴素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產生NH3一些常見的酶電極底物酶電極5′－腺苷酸5′－腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫酶Pt過氧化物過氧化氫酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L－氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt(H2O2)琥珀酸琥珀酸脫氫酶Pt(O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN－硝酸鹽硝酸鹽還原酶/亞硝酸鹽還原酶NH4+亞硝酸鹽亞硝酸鹽還原酶NH3（氣體）草酸草酸脫羧酶CO2（氣體）青黴素青黴素酶pH乳酸乳酸脫氫酶；細胞色素bPt，Fe（CN）-4L－氨基酸脫羧酶CO2L－精氨酸精氨酸酶NH4+L－天冬醯胺天冬醯胺酶NH4+本章目錄

酶的非水相催化6.1酶催化反應的介質水是酶促反應最常用的反應介質。但對於大多數有機化合物來說，水並不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物(底物)在水介質中難溶或不溶。由於水的存在，往往有利於如水解、消旋化、聚合和分解等副反應的發生。是否存在非水介質能保證酶催化？？1984年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質中進行了酶催化反應的研究，他們成功地在利用酶有機介質中的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物，明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應。酶非水相催化的幾種類型有機介質中的酶催化有機介質中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。適用於底物、產物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。酶在有機介質中由於能夠基本保持其完整的結構和活性中心的空間構象，所以能夠發揮其催化功能。氣相介質中的酶催化酶在氣相介質中進行的催化反應。適用於底物是氣體或者能夠轉化為氣體的物質的酶催化反應。由於氣體介質的密度低，擴散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。超臨界介質中的酶催化酶在超臨界流體中進行的催化反應。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質超臨界點的流體。離子液介質中的酶催化酶在離子液中進行的催化作用。離子液（ionicliquids）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構成的在室溫條件下呈液態的低熔點鹽類，揮發性低、穩定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩定性和區域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。本章目錄6.2有機介質反應體系非極性有機溶劑

酶懸浮體系(微水介質體系)

用非極性有機溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機相中。但仍然含有必需的結合水以保持酶的催化活性(含水量一般小於2%)。 酶的狀態可以是結晶態、凍幹狀態、沉澱狀態，或者吸附在固體載體表面上。與水互溶的有機溶劑

水單相體系 有機溶劑與水形成均勻的單相溶液體系。酶、底物和產物都能溶解在這種體系中。非極性有機溶劑

水兩相/多相體系 由含有溶解酶的水相和一個非極性的有機溶劑(高脂溶性)相所組成的兩相體系。不管採用何種有機介質反應體系，酶催化反應的介質中都含有機溶劑和一定量的水。它們都對催化反應有顯著的影響。反應體系對酶酯化反應的影響反應體系含1-三甲基矽-1-乙醇10mM，戊酸10mM，內標正十五烷，脂肪酶50mg，30℃，120rpm條件下振盪反應1：水飽和正已烷10ml，2∶pH7.2緩衝液5ml+正已烷10ml反應體系中水對酶催化反應的影響酶都溶於水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進行催化反應。所以酶在有機介質中進行催化反應時，水是不可缺少的成分之一。有機介質中的水含量多少對酶的空間構象、酶的催化活性、酶的穩定性、酶的催化反應速度等都有密切關係，水還與酶催化作用的底物和反應產物的溶解度有關。酶分子只有在空間構象完整的狀態下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構象。維持酶分子完整的空間構象所必需的最低水量稱為必需水（essentialwater）。有機介質中水的含量對酶催化反應速度有顯著影響。存在最適水含量。反應體系中有機溶劑對酶催化反應的影響常用的有機溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在水溶液中，酶分子均一地溶解於水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結構。在有機溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進行催化反應。根據酶分子的特性和有機溶劑的特性的不同，保持其空間結構完整性的情況也有所差別。極性較強的有機溶劑，如甲醇，乙醇等，會奪取酶分子的結合水，影響酶分子微環境的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。因此應選擇好所使用的溶劑，控制好介質中的含水量，或者經過酶分子修飾提高酶分子的親水性，避免酶在有機介質中因脫水作用而影響其催化活性。有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產物的分配，從而影響酶的催化反應。本章目錄6.3酶在有機介質中的催化特性底物特異性立體選擇性區域選擇性鍵選擇性熱穩定性

酶在有機介質中起催化作用時，由於有機溶劑的極性與水有很大差別，對酶的表面結構、活性中心的結合部位和底物性質都會產生一定的影響，從而顯示出與水相介質中不同的催化特性酶在有機介質中由於水分子的減少，相對來說酶分子的構象表現出比水溶液中更具有“剛性”特點。因而使通過選擇不同性質的溶劑來調控酶的某些特性成為可能。例如在有機溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質，誘導改變酶分子的構象，調控酶的底物專一性,、立體選擇性和手性選擇性等。由於引起酶變性的許多因素都與水的存在有關,因此在有機介質中酶的穩定性得到顯著提高。由於有機溶劑的存在,水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和醯基轉移等。在有機介質中進行的酶促反應，可以省略產物的萃取分離過程,提高收率。有機介質酶催化反應的優點某些酶在有機介質與水溶液中的熱穩定性

酶

介質條件

熱穩定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/2<26hT1/2<2min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/2<2min脂蛋白脂肪酶甲苯，90℃，400h活力剩餘40％胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/2=80minT1/2=15min枯草桿菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃活力剩餘95％T1/2<10min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/2>24hT1/2<10min限制性核酸內切酶（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低β-葡萄糖苷酶2-丙醇，50℃，30h活力剩餘80％溶菌酶環己烷，110℃水T1/2=140minT1/2=10min本章目錄6.4有機介質中酶催化反應的條件及其控制酶在有機介質中可以催化多種反應，主要包括：合成反應、轉移反應、醇解反應、氨解反應、異構反應、氧化還原反應、裂合反應等。主要應控制的條件有酶的種類和濃度底物的種類和濃度有機溶劑的種類水含量溫度pH離子強度本章目錄6.5酶非水相催化的應用

酶催化反應應用

脂肪酶肽合成青黴素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉酯各種酯類生產聚合二酯的選擇性聚合醯基化甘醇的醯基化蛋白酶肽合成合成多肽醯基化糖類醯基化羥基化酶氧化甾體轉化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定醇脫氫酶酯化有機矽醇的酯化手性藥物兩種對映體的藥理作用

藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾（Propranolol）萘普生（Neproxen）青黴素胺（Penicillamine）羥基苯呱嗪(Dropropizine)反應停（Thalidomide）酮基布洛芬（Ketoprofen）喘速寧（Trtoquinol）乙胺丁醇（Ethambutol）萘必洛爾（Kebivolol）S構型，治療心臟病,β-受體阻斷劑S構型，消炎、解熱、鎮痛S構型，抗關節炎S構型，鎮咳S構型，鎮靜劑S構型，消炎S構型，擴張支氣管S,S構型，抗結核病右旋體，治療高血壓,β-受體阻斷劑R構型，鈉通道阻滯劑R構型，療效很弱R構型，突變劑R構型，有神經毒性R構型，致畸胎R構型，防治牙周病R構型，抑制血小板凝集R,R構型，致失明左旋體，舒張血管1992年，美國FDA明確要求對於具有手性特性的化學藥物，都必需說明其兩個對映體在體內的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動力學情況。許多國家和地區也都制定了有關手性藥物的政策和法規。這大大推動了手性藥物拆分的研究和生產應用。目前提出註冊申請和正在開發的手性藥物中，單一對映體藥物占絕大多數。脂肪酶-位置選擇性酯化反應葡萄糖苷-6-O-醯基衍生物是一種可生物降解的非離子表面活性劑，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下進行選擇性酯化得到：糖酯的合成脂肪酶-消旋化合物選擇性酯化以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機溶劑介質中用脂肪酶(CCL)或豬肝酯酶（PLE）催化酯化反應，可得到較高光學純度的R-或S-酯。脂肪酶-消旋化合物的拆分有機介質中用脂肪酶(PSL)催化酯化用於γ-羥基-α,β-不飽和酯的拆分。可以避免副反應的發生。脂肪酶-內酯合成反應

-羥基酸或它的酯在脂肪酶催化下，發生分子內環化作用得到內酯化合物。內酯可繼續反應形成開鏈寡聚物.內酯化產物形式主要取決於羥基酸的長度外，也取決於脂肪酶的類型、溶劑及溫度等。生物柴油生物柴油是利用生物油脂生產的有機燃料，是由動物、植物或微生物油脂與小分子醇類經過酯交換反應而得到的脂肪酸酯類物質。可以代替柴油作為柴油發動機的燃料使用。

生物油脂的來源：菜子油，豆油，椰子油，棕櫚油、蓖麻油、棉籽油，葵花籽油，廢食用油等優點：（1）具有良好的環境屬性（2）具有較好的低溫發動機啟動性能。（3）具有較好的潤滑性能。（4）具有較好的安全性能。（5）具有良好的燃料性能。（6）具有可再生性能。從生物質到生物柴油生物柴油生產裝備美國生物柴油發展趨勢生物柴油的生產方法目前生物柴油主要是用化學法生產，採用酸、堿催化油脂與甲醇之間的轉酯反應，而生成脂肪酸甲酯。反應時間短，成本低。但在反應過程中使用過量的甲醇，而使後處理過程變得較為繁雜。能耗高；色澤深，在高溫下容易變質；酯化產物難於回收；生產過程有廢堿液排放新方法：生物酶法，在有機介質中，脂肪酶可以催化油脂與小分子醇類的酯交換反應，生成小分子的酯類混合物。條件溫和，醇用量小、無污染排放。缺點：對甲醇及乙醇的轉化率低，一般僅為40%～60%，酶的使用壽命短。副產物甘油和水難於回收，不但對產物形成抑制，而且甘油對固定化酶有毒性，使固定化酶使用壽命短。本章目錄

酶反應器7.1什麼是酶反應器酶和固定化酶在體外進行催化反應時，都必需在一定的反應容器中進行，以便控制酶催化反應的各種條件和催化反應的速度。用於酶進行催化反應的容器及其附屬設備稱為酶反應器。酶反應器是用於完成酶促反應的核心裝置。它為酶催化反應提供合適的場所和最佳的反應條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉化成產物。它處於酶催化應過程的中心地位，是連接原料和產物的橋樑。酶催化反應過程示意圖過程調控生物反應器

消毒原料預處理

產物分離提純

產品生物催化劑製備空氣除菌能量熱量回本章目錄7.2理想的酶反應器的要求生物反應器設計的主要目標：使產品的品質最高，生產成本最低。評價生物反應器的主要標準：反應器生產能力的大小和產品品質的高低。(4)應具有最佳的無菌條件，否則，雜菌污染使反應器的生產能力下降。(1)所用生物催化劑應具有較高的比活和酶濃度（或細胞濃度），才能得到較大的產品轉化率。(2)能用電腦自動檢測和調控，從而獲得最佳的反應條件。(3)應具有良好的傳質和混合性能。傳質是指底物和產物在反應介質中的傳遞。傳質阻力是反應器速度限制的主要因素。常見的酶反應器類型按結構區分攪拌罐式反應器（StirredTankReactor,STR）鼓泡式反應器(bubblecolumnreactor,BCR)填充床式反應器(packedcolumnreactor,PCR)流化床式反應器(FluidizedBedReactor,FBR)膜反應器(MembraneReactor,MR)按操作方式區分分批式反應(batch)連續式反應(continuous)流加分批式反應(feedingbatch)混合形式連續攪拌罐反應器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）分批攪拌罐反應器（BatchStirredTankReactor,BSTR）回本章目錄7.3各種酶反應器的特點反應器類型適用的操作方式適用的酶特點攪拌罐式反應器分批式,流加分批式連續式,游離酶固定化酶反應比較完全，反應條件容易調節控制。填充床式反應器連續式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應的速度。在工業生產中普遍使用。流化床反應器分批式流加分批式連續式固定化酶流化床反應器具有混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值的調節控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反應液也可進行催化反應。反應器類型適用的操作方式適用的酶

特點鼓泡式反應器分批式流加分批式連續式游離酶固定化酶鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高,適合於有氣體參與的反應。膜反應器連續式游離酶固定化酶清洗比較困難噴射式反應器連續式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實現酶與底物的混合，進行高溫短時催化反應，適用於某些耐高溫酶的反應(1)間歇式酶反應器又稱為批量反應器（BatchReactorBSTR）、間歇式攪拌罐、攪拌式反應罐。其特點是：底物與酶一次性投入反應器內，產物一次性取出；反應完成之後，固定化酶（細胞）用過濾法或超濾法回收，再轉入下一批反應。優點是：裝置較簡單，造價較低，傳質阻力很小，反應能很迅速達到穩態。缺點是：操作麻煩，固定化酶經反復回收使用時，易失去活性，故在工業生產中，間歇式酶反應器很少用於固定化酶，但常用於游離酶。(2)連續式酶反應器又稱為連續攪拌釜式反應器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）、連續式攪拌罐。向反應器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應達到平衡之後，再以恒定的流速連續流入底物溶液，同時，以相同流速輸出反應液（含產物）。優點是：在理想狀況下，混合良好，各部分組成相同，並與輸出成分一致。缺點是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。底物溶液進口反應液出口(3)填充床反應器填充床反應器（PackedReactor,PBR）,又稱固定床反應器。將固定化酶填充於反應器內，製成穩定的柱床，然後，通入底物溶液，在一定的反應條件下實現酶催化反應，以一定的流速，收集輸出的轉化液（含產物）。優點是：高效率、易操作、結構簡單等，因而，PBR是目前工業生產及研究中應用最為普遍的反應器。它適用於各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產物抑制的轉化反應。缺點是：傳質係數和傳熱係數相對較低。當底物溶度含固體顆粒或黏度很大時，不宜採用PBR。(4)流化床反應器流化床反應器（FluidizedBedReactor,FBR）。特點是：底物溶液以足夠大的流速，從反應器底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處於流化狀態。其流動方式使反應液的混合程度介於CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用於處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用於需要供氣體或排放氣體的酶反應（即固、液、氣三相反應）。但因FBR混合均勻，故不適用於有產物抑制的酶反應。(5)鼓泡式反應器鼓泡式反應器(bubblecolumnreactor,BCR)是利用從反應器底部通入的氣體產生的大量氣泡，在上升過程中起到提供反應底物和混合兩種作用的一類反應器。也是一種無攪拌裝置的反應器。鼓泡式反應器可以用於游離酶和固定化酶的催化反應。在使用鼓泡式反應器進行固定化酶的催化反應時，反應系統中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應器。鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易,剪切力小，物質與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應中常用的一種反應器。例如氧化酶催化反應需要供給氧氣，羧化酶的催化反應需要供給二氧化碳等。(6)膜反應器膜反應器（membranereactor,MR）是將酶催化反應與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應器。可以用於游離酶的催化反應，也可以用於固定化酶的催化反應。用於固定化酶催化反應的膜反應器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而製成的一種生物反應器。膜反應器可以製成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應器。連續攪拌罐—超濾膜反應器

簡稱CSTR-UFR。在CSTR（連續式攪拌罐）出口處設置一個超濾器。可以將小分子產物與大分子酶和底物分開，有利於產物回收。該反應器適用於顆粒較細的固定化酶、游離酶和細胞以及小分子產物與大分子底物。游離酶在膜反應器中進行催化反應時，底物溶液連續地進入反應器，酶在反應容器的溶液中與底物反應，反應後，酶與反應產物一起，進入膜分離器進行分離，小分子的產物透過超濾膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再迴圈使用。回本章目錄7.4酶反應器的選擇和使用影響酶反應器選擇的因素很多，但一般可以從以下幾個方面考慮：酶的形式(游離/固定化..)固定化酶的形狀底物的物理性質酶反應動力學性質酶的穩定性操作要求反應器製造、控制成本通常顆粒狀、片狀、膜狀或纖維狀固定化酶均可採用填充床反應器（PBR），而顆粒狀、粉末狀及片狀固定化酶均可使用於連續式攪拌罐（CSTR），膜狀固定化酶要用螺旋卷膜式反應器。在應用游離酶進行催化反應時，酶與底物均溶解在反應溶液中，通過互相作用，進行催化反應。可以選用攪拌罐式反應器、膜反應器、鼓泡式反應器、噴射式反應器等。可溶性底物適用於所有的反應器。難溶底物或者底物溶液呈膠體狀者，易堵塞柱床，可選用FBR。顆粒狀底物溶液可適用於CSTR。當反應過程需要控制溫度、調節pH時，選用CSTR更為方便。在反應器操作過程中，由於攪拌或液流的剪切作用，常會使酶從載體上脫落下來，或者由於磨損而使粒度變細，從而影響了固定化酶的操作穩定性。酶反應器使用中應注意的問題酶的穩定性對酶反應器的功效是很重要的。在操作過程中，有時需要用酸或堿來調節反應液PH。如果局部的pH過高或過低，就會引起酶的失活，或者使底物和產物發生水解反應。這時，可用加快攪拌已促使混合均勻。如果底物和產物在反應器中不夠穩定的話，可以採用高濃度的酶，以減少底物和產物在反應器中的停留時間，從而減少損失。防止微生物污染酶反應器操作中，生產能力逐漸降低，主要原因是固定化酶活性降低或損失。造成固定化酶活性損失的原因：（1）酶本身的失活；（2）酶從載體上脫落；（3）載體的破碎或溶解。回本章目錄7.5酶反應器的設計1、確定酶反應器的類型酶反應器的設計，首先要根據酶、底物和產物的性質，按照上一節所述的選擇原則，選擇並確定反應器的類型。2、確定反應器的製造材料由於酶催化反應具有條件溫和的特點，通常都是在常溫、常壓、pH近乎中性的環境中進行反應，所以酶反應器的設計對製造材料沒有什麼特別要求，一般採用不銹鋼製造反應容器即可。3、進行熱量衡算酶催化反應一般在30～70℃的常溫條件下進行，所以熱量衡算並不複雜。溫度的調節控制也較為簡單，通常採用一定溫度的熱水通過夾套（或列管）加熱或冷卻方式，進行溫度的調節控制，熱量衡算是根據熱水的溫度和使用量計算。對於某些耐高溫的酶，例如高溫澱粉酶，可以採用噴射式反應器，熱量衡算時，根據所使用的水蒸氣熱焓和用量進行計算。4、進行物料衡算酶反應動力學參數/底物用量/酶量/反應體積/反應器數量回本章目錄

酶的應用“綠色健康，“酶”力無限醫藥、洗滌劑、紡織、澱粉制糖、發酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒釀造、穀物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、飼料、皮革、造紙和化工等工業領域

酶參與了生物體內所有的生命活動和生命過程執行具體的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血酶等清除有害物質,起保衛作用-過氧化物酶，朝氧化物岐化酶等協同激素等生理活性物質在體內發揮信號轉換,傳遞與放大作用,調節生理功能-蛋白激酶催化代謝反應,建立各種各樣代謝體系與代謝途徑-葡萄糖、氨基酸、核酸代謝酶是生物學有力的研究工具基因工程工具酶基因組學蛋白組學酶和工農業生產與醫學實踐有著密切的關係工業用酶：澱粉糖業農業用酶：飼料醫療用酶：蛋白酶檢測試劑抗病毒等新藥物開發Contentsofchapter81、酶在醫藥方面的應用2、酶在食品方面的應用3、酶在輕工、化工方面的應用4、酶在環境保護中的應用GoGoGoGo5、酶在生物技術方面的應用Go8.1酶在醫藥方面的應用用酶