分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术课件

分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术在分子生物学技术上引领前行1LifeTechnologiesProfile

美国生命技术公司营业收入~$3.2B产品种类~50,000国家160员工数量9,600客户数量~75,000专利许可~3,600Note:LTMrevenueasofSeptember30,2009;doesnotincludeMassSpecJVrevenue2临床分子诊断基因治疗药物再生医学工业生物制药法医食品安全动物健康科研PCR技术测序技术细胞(分离,操作，分析)“ToolsProvider”提供工具“SolutionsProvider”提供解决方案AppliedBiosystems–分子生物学技术的领导者超过25年的分子生物学产品开发历程1982年,全球第一台蛋白质测序仪；1986年，全球第一台核酸测序仪1986年，全球第一个实时荧光定量技术和TaqMan®技术全球>30,000个实验室的>220,000仪器正在被使用3LifeTechnology食品微生物系统解决方案样品前处理Dynabead®磁珠富集MagMAX™Express核酸自动提取快速检测RapidFinder™常规qPCR检测超高通量的筛查OpenArray™芯片鉴定与分型MicroSEQ™ID基因分析灵活的组合方案，满足不同层次的应用需求4病原微生物样品制备

PrepSEQ™

快速离心核酸提取试剂盒AB专利的离心柱材料较化学法，更加有效去除PCR抑制剂步骤少、操作简单可处理多达750uL的样品无需额外的设备适合少量样品采用PrepSEQ™快速离心试剂盒，结果明显优于普通直接裂解；尤其对于存在PCR抑制剂的样品，普通裂解法可能无法检出，而PrepSEQ™快速离心法可以得到一致的结果样品：巧克力检测项目：沙门氏菌样品：布里奶酪检测项目：李斯特菌*标注的是因PCR抑制剂的存在导致样品中待测菌无法检出5病原微生物样品制备

SamplePCRcompatibleNAsolutionLysisMagneticParticles+BindingSolutionWash2XMagneticSeparationMagneticSeparationElutionMME-96核酸提取仪自动化高通量自动化的理想选择PrepSEQ™

核酸提取试剂盒提高核酸回收率有效去除抑制剂食品，环境及临床样品+自动化的核酸提取流程，一次最多处理96个样品6食品致病菌检测解决方案样品制备软件

RapidFinder™Express软件PrepSEQ™RapidSpin样品制备系统检测试剂MicroSEQ®

食品致病菌检测试剂盒仪器7500快速实时荧光定量PCR仪器PrepSEQ™NAExtraction

样品制备系统7食品及环境病原微生物检测致病菌系列沙门氏菌（AOACcertificated）单增李斯特菌（AOACcertificated）李斯特菌属（AOACcertificated）大肠杆菌O157:H7（AOACcertificated）阪崎肠杆菌空肠弯曲杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌弯曲杆菌多重检测：空肠/大肠/红嘴鸥金黄色葡萄球菌创伤、霍乱和副溶血性弧菌的多重检测定制设计环境和生物安全系列军团菌属定量检测试剂盒嗜肺军团菌定量检测试剂盒土拉弗朗西斯菌检测试剂盒炭疽芽孢杆菌检测试剂盒布鲁氏菌属检测试剂盒鼠疫耶尔森菌检测试剂盒8最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性引物、探针设计：基于SOLiD™测序技术分析结果新的设计，针对O157:H7特有的序列，避免O55:H7被测出-双重目标基因设计，提高特异性-将O55全基因组测序，并与O157相比较ORFs(bothstrands)GCcontentper1000bpO157:H7(EDL933)referencesequenceO157:H7SOLiD™coverageO55:H7SOLiD™coverageO157:H7uniquesequences9TaqMan实验数据验证：包括低浓度的O157:H7/HM不同菌株包括对非O157:H7的大肠杆菌菌株的检测不含O157的真实牛肉样品最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性10O157:H7检测试剂盒：8小时内获得结果6小时BHI增菌60分钟DNA提取40分钟PCR25g牛肉手工操作时间<1小时10分钟10分钟整个流程~8小时MicroSEQ®

大肠杆菌

O157:H7工作流程10分钟样品制备设置10分钟10分钟PCR设置市场上最快的检测方法已经获得AOAC及AFNOR的认可11MicroSEQ®

沙门氏菌检测操作流程–

快速获得结果，最少的手工操作时间<18小时获得结果过夜增菌提取反应设置

运行及分析1216SrDNA双氮养弧菌与创伤弧菌，解蛋白弧菌与副溶血性弧菌，最小弧菌与霍乱弧菌的亲缘关系很近基于公共数据库，AB自有数据库，特定基因测序分析，筛选出针对三个目标菌种的8个不同基因的19个AssayMicroSEQ微生物鉴定系统快速同时检测创伤弧菌，副溶血性弧菌，霍乱弧菌13弧菌多重PCR设计考虑到多重检测在一起的相互影响，三个不同的种分别设计了1-2套不同的Assay14优化配方，最终实现弧菌的多重检测通过不同的荧光标记，将副弧、霍乱、创伤这三个不同种的弧菌区分开来15开放的系统:满足不同的食品检测需求致病菌检测试剂盒沙门氏菌，单增李斯特菌大肠杆菌O157:H7空肠弯曲杆菌，金葡菌绿脓杆菌，副弧/霍乱/创伤军团菌,坂崎杆菌个性化订制引物、探针合成服务转基因检测试剂盒玉米转基因检测试剂盒大豆转基因检测试剂盒动物健康检测试剂盒禽流感，新城疫蓝耳病，猪胎毛滴虫猪肺炎支原体，猪瘟蓝舌病，副结核牛病毒性腹泻病毒牛呼吸道合胞体病毒

客户实验室设计合成实验室设计人类传染病检测试剂盒甲型H1N1检测甲型流感通用型流感亚型H5/H7/N1炭疽芽孢杆菌/布鲁氏菌鼠疫耶尔森土拉弗朗西斯菌肉类ID鉴定试剂盒猪肉ID鉴定牛肉ID鉴定鸡肉ID鉴定1617OpenArray®定量PCR微流体芯片

HydrophilicHydrophobicDataPointsperdaywithOpenArray基因分型基因表达70,00032,000OpenArrayPlateLayout子阵48(12x4)通孔:33nl64通孔/子阵(8x8)SPATIALMULTIPLEXING…3072个通孔：相当于32x96孔板或者8x384微孔板18TaqManOpenArray玻片:格式SNP位点数163212864192256样本数1449648241612XXXXXXOpenArray®SNP芯片：格式19为什么使用OpenArray做病原体检测一次实验，检测并定量多种病原体生物

一次检测多样本

快速出结果

灵敏度和准确性优于标准的培养法和免疫法LifeTech可以帮助用户设计所需的芯片20应用案例：人类病原体检测来自RobertSlinger小组在加拿大安大略省儿童医院的实验结果从临床样品(咽喉拭子棒）快速检测多种呼吸道病毒或病菌.

验证在OpenArray平台上检测纳升级别的qPCR反应的适用性“WewantedtoseeifwecoulduseqPCRtofigureoutthecauseofinfections,andthoughttheOpenArrayplatformhadthemostpotentialbecausewecoulddothousandsofreactionsatonce,”–RobertSlinger,CHEO21Viral

InfluenzaA-panInfluenzaAH3,H1&H5InfluenzaAH1Swine2009strainInfluenzaAN1oseltamivir-resistancemutationInfluenzaBRespiratorysyncytialvirusAandBParainfluenzavirus1-4RhinovirusEnterovirusCoronavirusOC43,NL63,HKU1,229EHumanmetapneumovirusBocavirusAdenovirus一张芯片整合多种呼吸道病原体检测BacterialMycoplasmapneumoniaeChlamydophilapneumoniaeLegionellapneumophilaMycobacteriumtuberculosisStreptococcuspneumoniaeStreptococcuspyogenesStaphylococcusaureusMethicillin-resistantStaphylococcusaureusStreptococcusdysgalactiaesubsp.Equisimilis(GroupCandGstreptococci)Streptococcusagalactiae(GroupBstreptococcus)HaemophilusinfluenzaeMoraxellacararrhalisBordetellapertussisBordetellaparapertussisOnesample每个样本检测22种呼吸道病毒和16种呼吸道细菌

每张芯片检测12个样本

每个检测3重复

每个病毒检测3个target

每个和样品8个空白对照内参人工合成对照qPCRAssays22MicroSEQ®微生物鉴定系统23微生物鉴定分型发展的三个阶段

第一阶段：依据表型鉴定分型培养、格兰氏染色、生理生化、形态学等黄金时代：上世纪80年代-本世纪初

第二阶段：片段长度多态性分析

限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、细菌的核糖体基因分型(Ribotyping)、多位点序列分析(MLST)、扩增片段长度多态性(AFLP)、重复序列扩增(rep-PCR)黄金时代：本世纪初-至今

第三阶段：基因序列分析（分子生物学的方法）采用测序技术，确定目标基因的每个碱基黄金时代：现在-未来5-10年/下一代单分子测序技术产生24

基于16S核糖体基因测序的鉴定方法

伯杰氏手册推荐细菌命名学的新标准《伯杰氏系统细菌学手册》采用16SrDNA测序提供更高的分类学信息

快速准确提供鉴定结果客观性，重现性好方便不同团体、实验室间信息共享和交流正在成为微生物鉴定的金标准25MicroSEQTM微生物鉴定系统不需要事前掌握微生物的信息

微小的可见的单菌落即可无需革兰氏染色无需生化试验无需鉴定的经验Easy5-stepWorkflow26结果–数据比对结果种最高匹配同源性–遗传进化树差异27

MicroSEQ®ID经过验证的强大数据库全部经过验证16S

500: 2020entries16S全基因: 1261entriesD2(真菌): 1113entries每隔一年半定期更新新增加的菌最新的命名原则包括诸多环境分离菌的信息使用者可以登录公司网站提供建议最大，最全面且经过验证的细菌和真菌数据库28MicroSEQID鉴定技术的特点

MicroSEQID的方法准确重现性好稳定简单将不能或难以鉴定的微生物种类从20％下降到2％！29微生物鉴定及菌株分子分型

满足不同层次的应用需求MicroSEQ™微生物鉴定系统基于16SrRNA序列测定实现细菌在种水平的鉴定

基于核糖体大亚基(LSU)序列测定实现真菌在种水平的鉴定菌株分型的分子平台测序检测MLST片段分析AFLPMLVA微生物耐药机理的研究SNaPshotMultiplex SSCP30遗传分析仪在MLVA研究中的应用多重PCR选择正确的扩增引物是取得成功的关键16个甚至更多的STR位点同时被扩增7repeats8repeatsSTR位点由特定引物延伸的旁侧序列具有保守性不同菌株的串联重复序列拷贝数存在差异AMELD3TH01TPOXPentaDPentaEFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遗传分析仪电泳分离PCR扩增产物/片段结合不同的荧光染料标记和迁移率的修饰技术，实现多重分析31STECO157/SalmonellaTyphimuriumProtocolMLVA是食源性微生物分型国际组织Pulsenet推荐的食品微生物分型方法，中国CDC及各省级CDC均设立相关机构参与其中.32大肠杆菌7个位点的MLVA，实现对O157:H7的分型Lindstedt,etal.(2003)Ann.Clin.Microbiol.Antimicr.,2,12.SevenlocusMLVAschemeinasingledyechannelIdentified47distinctMLVApatternsamong73O157:H7strainsSequencealignmentoftheVhec4VNTRlocifromisolatesG5300andIHE5344.TheresultsfromthesequencingshowthattheelectrophoreticmobilityshiftbetweenisolatesIHE5344(upperstrand)andG5300(lowerstrand)iscausedbydifferentnumbersofAAATAGrepeatunitsaloneEscherichiacoliO1