第二章 种子扩大培养

第二章第五节种子扩大培养种子必须具备的条件几个概念

微生物的扩大培养

种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。一、种子扩大培养流程图

实验室种子制备阶段〔一级种子培养〕生产车间种子制备阶段〔二级种子培养、三级种子培养〕二级发酵三级发酵砂土孢子冷冻枯燥孢子斜面孢子摇瓶液体培养茄子瓶斜面培养固体培养基培养〔一〕实验室种子的制备

两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程

在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。1．孢子制备

孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响，不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。(1)放线菌孢子的制备琼脂斜面培养基：适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等；碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)。碳源丰富：生理酸性环境，不利于放线菌孢子的形成；氮源丰富：有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，枯燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培养时间为5～14天。(2)霉菌孢子的制备培养基：天然农产品如大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等；营养成分较适合霉菌的孢子繁殖；培养基外表积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25~28℃，培养时间为4～14天。(3)细菌培养物的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。培养温度：多数为37℃，少数为28℃。培养时间：1—2天，产芽孢的细菌那么需培养5一10天。

实验室种子的制备：

e.g产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种斜面试管获得孢子250ml茄子瓶〔大米或小米〕25~28℃，4~14天成熟〔在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存〕。(4)斜面种子的制备斜面种子：在试管或扁瓶内，琼脂固化的培养基外表上生长的菌种培养物。制备流程：略制备过程本卷须知：A

琼脂要完全浸没在营养液内，用量1.0%-2.5%B营养液中最好不含易沉淀的固形物；C装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；D灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水；F微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量参加。影响斜面种子质量的因素(1)原材料质量，水质，培养基pH(2)灭菌条件(3)接种量(4)培养室温度、湿度、通风(5)培养时间(6)有害气体或挥发物〔培养室内不要安紫外灯〕(7)冷藏条件2.液体种子制备

种子制备将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。〔二〕生产车间种子制备

1.摇瓶种子制备三、种子培养

工业微生物培养的类型静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养

(anaerobicculturing)通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性培养(aerobicculturing)。种子扩大培养的方法：1外表培养法〔surfaceculturing)：

好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为液态外表培养和固体外表培养。相对于容器内培养基体积而言，外表积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的外表积越大，生长速度越快。4.载体培养法以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可严格控制，可反复使用。要求：耐蒸汽加热或药物灭菌四、种子质量控制〔一〕影响孢子质量的因素及控制1、培养基2、培养温度和湿度3、培养时间和冷藏时间4、接种量1.培养基培养基原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮〔wheatbran〕、霉菌用的大〔小〕米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg2+、Ca2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。解决措施

斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用；严格控制灭菌后的培养基质量；斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中有利于孢子生长。配制孢子培养基还应该考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择。在制备固体培养基时有两条经验：①供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势；②作为选种或别离用的平板培养基，那么需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。2.培养温度和湿度要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方枯燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少，相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在40％～45％，在南方相对湿度控制在35％一42％，所得孢子质量较好。

一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高墙养箱内的相对湿度。为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长，现代化的培养箱恒温、恒湿，并可换气，不用人工控制．最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微生物的最适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的最适相对湿度。

3.培养时间和冷藏时间孢子的培养工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子。孢子过于年轻经不起冷藏；过于衰老会导致生产能力下降；孢子培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。冷藏时间：宜短不宜长。如土霉素菌种孢子斜面培养4天左右，即于4℃冰箱保存，发现冷藏7-8天菌体自溶，而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素生产菌，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。4.接种量〔二〕影响种子质量的因素1.培养基原材料质量：种子培养基原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同。P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，参加其他的营养物〔麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆〕，也对种子质量多少有些影响。

2.培养条件：

六种子质量标准

不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量有所不同。判断种子质量的优劣需要有丰富的实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准：(1)细胞或菌体种子培养的目的：获得健壮和足够数量的菌体。种子质量的重要指标：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。(2)生化指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况且变化为指标的。(3)产物生成量种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。(4)酶活力测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如：土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。此外，种子应确保无任何杂菌污染。6．种子异常的分析(2)菌丝结团(3)菌丝粘壁思考题P49常用的