细胞生物学常用技术1

细胞生物学常用实验技术

精选课件

cellularlevelSubcellularlevel

Molecularlevel精选课件精选课件显微技术细胞别离技术细胞培养技术细胞组分的分级别离细胞示踪技术细胞分子生物学技术精选课件一、显微镜技术microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

纳米

=10-9m

Å

埃

=10-10m

(一)光学显微镜技术

利用光线照明,将微小物体形成放大影像的仪器

精选课件1.显微镜的分辨率显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。

d=

光学显微镜的分辨极限0.2μm0.61λ

nsinθ

精选课件100μm0.2μm精选课件2.光镜标本切片的制备

(1)

固定

定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细胞中大分子间形成交联，保持细胞中原有结构的形态和位置的过程。

固定的目的：

A防止组织自溶或腐败

B保持细胞原有的形态

C保持细胞各种成分的原有位置

常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛

精选课件(2)脱水

定义：借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程。

常用的脱水剂：酒精

(3)包埋

定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。

常用的包埋剂：液体石蜡、树脂

(4)切片

1-10μm

精选课件〔5〕染色采用某些化学物质特异性或选择性地与细胞内的某些成分相互作用，从而原位显示细胞某种成分或结构的方法A选择性染色考马斯亮蓝–蛋白质Brachet反响

精选课件hematoxylin-eosin精选课件B特异性染色

酶+底物

抗原+抗体+substrateantigenantibody************酶标记：免疫组织化学技术荧光标记：免疫荧光技术精选课件3.荧光显微镜技术

(1)原理荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光

可见光紫外光红外光shortlongλ

精选课件〔2〕荧光显微镜的根本构造A紫外光光源B二向色镜：反射短波光线，透过长波光线C滤光片精选课件〔3〕常用的荧光染料A有机染料荧光素罗丹明FITC精选课件B量子点quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素构成的半导体纳米结晶良好的光学稳定性抗光漂白性精选课件精选课件精选课件〔4〕应用A免疫荧光显微技术〔Immunofluorescencemicroscopy〕抗体+荧光染料

精选课件精选课件精选课件B绿色荧光蛋白GFP

精选课件精选课件4.相差显微镜〔phasecontrastmicroscope〕(1)原理波长颜色振幅亮度速度相位

精选课件(2)应用

活体细胞观察精选课件5.激光扫描共焦显微镜〔LaserScanningConfocalMicroscope〕(1)原理在显微镜根底上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。单色激光光源光源后－照明针孔－点光源检测器前－探测针孔分层扫描三维重建共扼精选课件精选课件〔2〕应用A细胞的三维重建B细胞定量荧光检测DNARNA蛋白质含量C细胞内Ca2+pH动态检测D细胞间通讯精选课件果蝇胚胎原肠胚精选课件精选课件精选课件精选课件〔二〕电子显微镜技术利用电子与固体样品作用时所发出的信息,对样品进行微区观察和分析的技术亚显微结构超微结构1.电子显微镜的特点高分辨率理论上d=0.002nm实际上d=0.1nm生物标本d=2nm高放大倍率1,000,000精选课件阴极阳极聚光镜〔电磁透镜〕物镜中间镜投影镜电镜照片照相底片真空、上下颠倒2.透射电子显微镜〔Transmissionelectronmicroscope,TEM〕(1)根本构造

精选课件(2)超薄切片的制备

A固定戊二醛:蛋白质锇酸:C=C(膜结构)

精选课件B脱水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋

单体树脂加温聚合

D切片

500–700Å

E

重金属染色U(醋酸双氧铀)Pb(柠檬酸铅)

精选课件精选课件NADP酶反响嗜锇反响TPP酶反响精选课件2.扫描电子显微镜〔Scanningelectronmicroscopy,SEM〕精选课件(1)原理二次电子(2)分辨率3-10nm(3)样品的制备A固定B脱水C枯燥临界点枯燥D染色AuPt精选课件精选课件精选课件透射电镜利用穿透标本的电子进行成像(散射)观察组织的二维切片扫描电镜利用标本外表发射的二次电子成像观察组织的外表三维结构精选课件〔三〕扫描探针显微镜〔Scanningprobemicroscope,SPM〕1.扫描隧道显微镜使用原子尺度的探针在标本外表扫描，在探针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本外表形貌变化的隧道电流。分辨率高可在非真空状态下工作直接观察大分子的三维结构精选课件2.原子力显微镜通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察外表的微观信息。样品无需具有导电性可在三态下工作活细胞外表及生物大分子空间伸展及其结晶体外表观测精选课件二、细胞别离技术〔cellseparation〕从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞消化EDTA

细胞间连接胰酶细胞外基质精选课件二、细胞别离技术〔cellseparation〕从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法1.制备单一细胞悬液组织单一细胞消化EDTA

细胞间连接胰酶细胞外基质精选课件2.别离不同类型细胞(1)离心〔centrifugation〕大小密度形状小轻不规那么大重圆形精选课件(2)免疫磁珠法

利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞别离出来。Fe2O3或Fe3O4颗粒

+

单克隆抗体免疫磁珠精选课件精选课件(3)

流式细胞仪(flowcytometry)

能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或化学特性的技术

A原理:

抗原+抗体*荧光标记

B样品制备

细胞悬液制备细胞固定细胞染色精选课件精选课件精选课件

B应用*细胞分选

cellin10005000cells/sec*细胞大小测量*DNA含量测定*免疫表型分析*细胞功能分析*细胞凋亡研究精选课件细胞周期分析精选课件

药物处理前后HT29细胞的流式细胞分析结果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB精选课件精选课件

ND-1-QD605标记不同大肠癌细胞的流式细胞定量分析精选课件(4)激光捕获显微切割技术〔Lasercapturemicrodissection，LCM〕从组织切片中精确别离获取单一细胞的方法

精选课件工作原理及过程:A制备组织切片B镜下将组织切片覆以薄膜C激光束切割特定细胞或区域D收集管收集

精选课件精选课件精选课件三、细胞培养技术〔Cellculture〕从活体组织中别离出特定的细胞，在一定的条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法invitro用培养细胞做实验invivo用动物做实验精选课件1.细胞培养的条件(1)固体外表：培养瓶、培养皿

(2)培养基常见培养基：1640DMEM

精选课件(3)无菌无菌操作：超净工作台、火焰消毒等培养液中参加抗菌素器械、溶液消毒〔烤箱、高压灭菌、过滤〕(4)其他温度37℃湿度100%CO2浓度5%精选课件2.细胞培养的传代

原代培养:直接取材于有机体的细胞培养取材切割消化培养

传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中取出，以1:2以上的比例扩大培养

原代培养

传代培养(保持分化特性)

传代精选课件精选课件3.细胞系〔Cellline〕在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。

变异细胞

细胞系HeLa人宫颈癌上皮细胞3T3小鼠成纤维细胞无限繁殖精选课件相差显微镜观察培养中的HeLa细胞精选课件4.细胞融合〔Cellfusion〕〔1〕定义在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。异核体杂交细胞分裂精选课件〔2〕促融方法生物学方法：仙台病毒化学方法：PEG物理方法：电脉冲打孔仪〔3〕应用A细胞核和细胞质间的相互作用B膜蛋白的流动性精选课件C

基因定位D

单克隆抗体制备

B淋巴细胞肿瘤细胞MousecellHumancelldivision精选课件精选课件精选课件E细胞周期相关因子的发现精选课件四、细胞组分的分级别离通过逐级别离对细胞内细胞器和各种成分的化学性质和功能进行研究的方法。匀浆分级别离分析

精选课件匀浆液膜细胞器大分子低渗超声去污剂强制过滤研磨

细胞破坏精选课件〔一〕离心法用于别离细胞器和大分子

配平低温精选课件1.差速离心法别离对象:不同大小和形状的组分〔细胞核、细胞器〕具体方法:由低速到高速逐级沉降(repeat)精选课件精选课件2.速度沉降法别离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S)比差速离心方法更精细具体方法:在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质

精选课件3.平衡沉降法别离对象:密度不同的组分〔与大小、形状无关〕具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离心介质〔20%-70%蔗糖、CsCl〕通常采用超速离心

精选课件〔二〕层析法〔柱层析〕主要用于别离、纯化蛋白质

填充柱填料〔固定相〕流动相精选课件1.离子交换层析层析介质:阴离子或阳离子树脂别离原理:电荷

精选课件2.凝胶过滤层析层析介质:凝胶别离原理:分子大小

精选课件3.亲和层析层析介质:基质+抗体底物别离原理:亲和性精选课件精选课件4.高压液相层析HPLC基质粒度小〔3-10μm〕、分辨率高、别离速度快

精选课件(三)电泳法主要用于别离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳别离对象:核酸支持介质:琼脂糖凝固点40-45℃不同浓度凝胶具有不同孔径电泳缓冲液:TAE\TBE染料:溴化乙锭EB精选课件(三)电泳法主要用于别离蛋白质、核酸1.琼脂糖凝胶电泳别离对象:核酸支持介质:琼脂糖