胶体金试纸条的制备

免疫胶体金技术简介Immunecolloidalgoldtechnique2021-1-27整理课件目录1胶体金技术的种类2胶体金的合成3胶体金的标记与纯化4胶体金免疫层析法试剂的组成5胶体金免疫层析试纸的应用7胶体金技术的开展胶体金免疫层析试纸的检测模式6整理课件胶体金免疫层析〔GoldImmune–ChromatographicAssay,GICA〕技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术开展而来的，其本质为一种固相反响的ELISA,并用胶体金来代替底物显色。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒外表的包被过程。整理课件胶体金技术的开展

1939-----雏形Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的外表抗原。1974------实现间接免疫金染色法Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法整理课件胶体金技术的种类及优点快速免疫金渗滤法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜免疫测定。主要由两局部组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒整理课件

免疫层析法(immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后开展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流〔lateralflow〕)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质那么越过该区域而被别离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。整理课件免疫胶体金技术的特点优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染；GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。枯燥包装的试剂可在室温保存一年以上。

成为目前“病人身边检验〞〔point-of-caretesting，POCT〕中广为应用的方法。整理课件最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器CardiacReader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。缺乏：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。整理课件胶体金的合成①白磷复原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；②白磷复原法(1925年)经改进后，可合成5～12nm大小的金颗粒；③抗坏血酸复原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒；④柠檬酸三钠复原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；⑤乙醇—超声波复原法(1980年)可合成6～10nm大小的金颗粒；⑥硼氢化钠复原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒；⑦单宁酸—柠檬酸三钠复原法(1985年)可合成3～17nm大小的金颗粒。整理课件胶体金合成将100ml的0.1％H2AuCl4参加200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，参加一个磁力条并将溶液加热至沸腾。向沸腾的溶液中参加1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O当获得深红颜色的溶液时停止加热制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠复原法整理课件胶体金粒径（nm）1％柠檬酸三钠加入量（ml）*呈色λmax162.00橙色518nm24.51.50橙红522nm411.00红色525nm71.50.70紫色535nm胶体金的合成整理课件本卷须知

〔1〕氯金酸易潮解，应枯燥、避光保存。

〔2〕氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。

〔3〕用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。

〔4〕是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后枯燥备用。整理课件胶体金的质量鉴定优质金颗粒和劣质金颗粒

劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大。透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度理想的金颗粒大小根本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。整理课件双电层结构保证了胶体金的稳定性，使金颗粒始终以悬浮状态存在。胶体金溶液通常由呈单一分散状态的金颗粒组成，金颗粒直径在1-100nm之间，而稳定的金溶液那么要求金颗粒维持在某一固定直径不变。蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正电时，能与胶体金所带的负电荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通过疏水作用将蛋白结合至金颗粒外表；有些蛋白那么可通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共轭连接。胶体金的蛋白标记整理课件金标样本程序将胶体金调整至正确的pH值确定最小蛋白含量最终结合〔标记〕纯化整理课件胶体金调整正确的pH值

胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。

需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1NHCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.整理课件常见蛋白标记条件整理课件最小蛋白用量确实定〔1〕光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液〔1ml〕，分别参加5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各参加1ml10%NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。整理课件〔2〕目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后〔由5μg～45μg另设对照管〕，各取等体积顺序参加一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别参加0.1ml10%氯化钠，依表顺序进行。整理课件发现1、2号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3号管虽然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而4、5号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4号管的蛋白量。整理课件最终结合〔McAb〕取100ml金溶液，调整pH值至8.2调整滤过和离心的抗体溶液〔0.1μg/μl〕至pH8.2当金溶液在快速搅拌时要逐滴参加定量的抗体〔蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定量〕，大约5分钟加完在金标溶液中参加10ml滤过的10％BSA至终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。整理课件纯化超速离心法、凝胶过滤法胶体金颗粒/nmpH标记蛋白质离心力/g时件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5链霉亲和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060几种免疫金探针离心纯化条件整理课件胶体金免疫层析法试剂的组成整理课件样品垫(Samplepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；调节样品液pH值或粘度等。样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以枯燥，该工艺可防止使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。整理课件结合垫(Conjugatepad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：

-吸附一定量的金标结合物颗粒；

-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；

-保持金标结合物颗粒的稳定性；

-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。玻璃纤维膜/聚酯纤维膜整理课件硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman等国外公司的硝酸纤维素膜。

NC膜的作用：

-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反响；-反响在NC膜上显色，读检测结果NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、外表活性剂、蛋白结合力、强度、外表质量、厚度、批间均一性等。整理课件硝酸纤维膜的选择膜的分类标准(μm和s)µm:指的是膜孔径换算情况大致为：8μm=135s；6μm=180s不同秒数的膜对反响的影响通过速度越快和包被在T线的物质反响时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反响时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反响时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反响不一定就能够真正的提升灵敏度。

135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.整理课件片材：

不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。吸收垫(AbsorbentPad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；吸收纸的作用：

主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。整理课件胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式疫病抗原检测竞争模式小分子物质检测SPA/蛋白G模式疫病抗体检测整理课件双抗体夹心模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色整理课件竞争模式判定检测线质控线阳性不显色显色阴性显色显色整理课件SPA/G蛋白模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色整理课件胶体金免疫层析试纸质量检测整理课件胶体金免疫层析试纸的应用在兽药残留检测中的应用Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶联BSA的克伦特罗作为T线，以竞争模式组装成试纸，用于样品的克伦特罗残留检测，为我国食品平安检测提供了有效的工具。之后Zhang的团队采用同样的模式制备并组装成功两类兽药残留检测试纸，分别为磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析试纸，为我国兽药残留快速检测技术的开展奠定了根底。在兽医疫病检测中的应用Bhakar等应用相应的单抗标金，建立了阿米巴虫抗原检测方法。Kameyama等