大学土壤微生物分离实验报告

从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定实验报告生物科学与技术系09食品（2）班姓名：xxx学号：xxx从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌前言：在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。实验目的：1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。2、学习、掌握微生物的鉴定方法。3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pourplatemethod)、涂布平板法(spreadplatemethod)、稀释摇管法(dilutionshakeculturemethod)、平板划线分离法（stesakplatemethod）。此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细（图中左侧梯形为三角瓶，其中加入49.5ml无菌水与0.5g土样，土壤溶液稀释度为10-2依此类推，右侧三试管中土壤稀释度分别为：10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）1.4.3混菌测定菌落数的方法1）细菌取10-6，10-7两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。2）放线菌取10-3、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管吸出1ml加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。3）霉菌取10-2、10-3两管稀释液各1ml，分别接入相应的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在熔好的马丁氏固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌平板。4）酵母菌在3）即可能分离到。1.4.4培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28~30oC恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。1.4.5平板划线分离微生物1、倒平板按无菌操作要求，在洁净工作台或在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固体培养基（约50oC），倒入无菌培养皿，倒量以铺满皿底为限，平放待其冷却凝固，备用。2、划线分离使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。3、培养方法同“土壤稀释分离”。菌落观察从培养好的未知平板中，挑选8个不同的单菌落，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将观察结果填入表4-1。1.4.6斜面接种1、取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名，日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上培养基斜面中。2、接种方法用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划（如图），方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。接种后恒温培养[同1.4.4]。2.试验结果与讨论从实验结果中可以推断出土壤中分离的微生物的种类，根据菌落数判断土壤中微生物的含量，实验过程中很多没注意的事项，可能影响实验结果的正确性。2.1实验的结果 区分和识别各大类微生物通常不外乎包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形成）等两方面的观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映，故每一大类微生物都有一定的菌落特征，即它们在形态大小、色泽透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异，一般根据这些差异就能识别大部分菌落。（一）菌落数观察记录表培养基天数浓度第一天第二天第三天第四天第五天第六天①②①②①②①②①②①②马丁氏10-217232431303734554164458610-312193224434273549573166高氏一号10-432454867638974999816712720810-514627163724483064578183牛肉膏蛋白胨10-6223323547859107111281310-78235124829543369407142（二）未知菌落的形态观察记录表菌落号培养基湿干菌落描述判断结果厚薄大小松密大小表面边缘隆起形状颜色透明度正面反面水溶性色素1牛肉膏蛋白胨薄小光滑湿润整齐凝胶状淡黄淡黄无半透明细菌23高氏1号厚大致密小干燥多皱绒状颗粒状乳白乳白无不透明放线菌45马丁氏较厚较大疏松大干燥粗糙地毯状低凹浅红粉红无不透明霉菌6四大类微生物菌落的基本特征菌落形态

细菌菌落表面湿润，薄而小酵母菌菌落表面湿润，厚而大放线菌菌落表面干燥，密而小霉菌菌落表面干燥，松而大附加说明：1.三根试管中的菌形态特征比较明显，能够辨认区分，霉菌菌苔干燥，较松，所以表面粗糙；细菌菌苔湿润，表面光滑，整体扁平，呈较透明状态；放线菌菌苔较干燥，长得较致密。2.倒平板时，时间的掌控至关重要，操作过慢将导致部分培养基先凝固，平板不平。3.划线时组员应待培养基凝固后划线，否则部分平板会被划破；随着实验的进行，组员划线有所进步。4.斜面接种：接种环较细，力度各方面较难把握。操作时，应尽量细心，小心的操作。2.2讨论2.2.1实验可靠性分析：由于一些实验操作细节处理不当，实验的结果可能存在一些误差。但总体上实验的结果还是具有一定可靠性的。2.2.2、注意事项：1、称药品后应做好标志，勿与其它药品混在一起；称完药品应及时盖紧瓶盖。2、注意pH值不要调过头，以免影响培养基内各离子的浓度。3、使用高压灭菌锅应严格按照操作程序（加水、排冷空气、降零）进行，避免发生事故；灭菌时操作者切勿擅自离开。4、应用记号笔在相应位置注明培养基的名称、组别、日期。5、干热灭菌时消毒箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与消毒箱内壁的钢板接触，以防包装纸烤焦起火。6、倒平板时时间要掌握好，避免培养基凝固，并且倒完后应当轻轻摇动平板两圈，使平板够平；待培养基凝固后划线，力度要适当，尽量不要将培养基划破。7、接种时，应尽量挑取生长较好，比较纯的。8、在接种时候应先用酒精灯将接种环前面的铂丝烧红，即对其进行灭菌；待温度降下来之后再接种。每次接种完后，要进行下一次接种之前，都要采取同样的方式。9、应即时对试管和平板进行观察，并做相应的记录。10、一般土壤中，细菌最多，放线菌和霉菌次之，而酵母菌主要见于果园和菜园土壤中，故从土壤分离细菌时应取较高的稀释度，否则菌落将连成一片而不能计数。11、放线菌的生长时间比较长，故制作平板时，培养基的量应多加一点。12、观察菌落特点时应选择分离的较开的很大的菌落，对培养基和试管要编好号码，不要随意移动开盖，以免搞混菌号或受到污染。13、实验完成后，应对实验数据的收集、处理和筛选。认真比对分析并作好记录，通过老师的指导及查阅相关文献对数据进行正确的筛选和整理，最终得到实验结果。2.2.3心得体会：通过实验我们学习了微生物实验中较基本的操作技能，掌握了配置培养基的一般方法和步骤、从土壤中分离微生物的方法，对无菌操作技术有了一定的了解，同时使组员的合作更加高效、密切。（2）在做关于分离实验时，无菌操作特别重要。因操作不当很容易感染，使所做的平板或斜面失败，故操作前应先对所要使用的物品进行紫外线灭菌，（包括操作前要给自己的手用75%的酒精消毒）；操作时应严格遵守操作规程，勿将实验操作在无菌工作台外进行，避免因人为因素而使实验产生误差。（3）掌握足够的理论知识是我们能够较好的理解和完成实验的一个先决条件。因此，我们要学习好相关的理论知识，做好实验前的预习工作。（4）根据不同的微生物生长对不同环境适应能力不同，实验中我们加入一些特定的物质（如链霉素等），抑制那些不适应该环境的的菌种的生长从而筛选出我们所需的菌种。（5）微生物与我们生活息息相关，在食品行业中至关重要，作为食品专业的学生应认真学习这门学科，并掌握其实验操作。参考文献：何国庆食品微生物学《中国农业大学出版社》2009年李洪臣杨秀艳四大类群微生物菌落的比较《生物学教学》2007-11年陈坚、刘和、李秀芬、华兆哲《环境微生物实验技术》2008年林先贵土壤微生物研究原理与方法《高等教育出版社》2010-3年【abstract】Throughseveralmethodsandtechniques,wegetfourtypesofsoilbact