国家重点基础研究发计划（重大科学研究计划）课题年度报告

国家重点基础研究发展计划（科学研究计划）项目编号2012年11月21一、年度计划执行情况2012年度主要针对集成化蛋白质组定量分对蛋白质的回收率可达到95%；接口对蛋白质的回收率可达到94%，可用于进一步蛋白质的定量分析；在酶解反应器方面：1）（IMER基质的亲水性IMER，结合微波辅助，可在15s完成标准蛋白质的酶解，5mins内完成对大肠杆菌提取蛋白的酶解，鉴定到333个蛋白质；4）建立一种集蛋样品损失，对蛋白质灵敏度比传统方法提高了5倍；0.1L4galectin-3bindingprotein可以作为移细胞株蛋白提取物分析，发现了24种蛋白质发生了明显变化；10万个细胞中定量到约1700个蛋白质；2）构建了基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化质鉴定数量提高10%左右，分析时间缩短1倍；3）建立了离子交换色谱-在线酶解-反相色谱-质谱的集成化蛋白质定量分析系统，该系统的定量RSD值为种蛋白质在低转移细胞中高表达，9种蛋白质在高转移细胞中高表达；对定量的蛋白质组学新方法，该方法对标准蛋白最低定量检测限为0.34amol，相对偏差RSD<1.58%，动态范围1-105；2）构建了二维阵列液相色谱高丰度蛋非糖肽来实现蛋白质组样品准确定量分析。应用到两种人类细胞系ChangLiverHepG233个糖蛋白在两个细胞系间的表达具有显著差异性，并对其中2种蛋白质进行了验证。SCI7213（枪头🎧口端内径为450μm管在重物的重力作用下自由落入盛水烧杯中，2mn后将毛细管从水中取🎧。毛膜外径即为枪头🎧将石英毛细管插入中空纤维膜两端，插入长度约1cm度根据Peek接头的长度适当调整，大致为4cm。20μL，通入中空纤维膜接口，收集组分通过BCA法测定浓度，BSA过膜后的回收率可达94%±1.3%(n=3)，可满足定量分析的需求。亲水性基于聚合物微球基质的亲水性本课题利用乙烯基-2-吡咯烷酮所带有的双键与聚合物微球表面双键反应进行修饰，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺对胰蛋白酶的羧基进行活化后与微球表面的氨基键合，制备了一种新型亲水性IMER。利用牛血清白蛋白(BSA)对其性能进行评价，通过质谱鉴定和数据库搜索得到序列覆盖率为66.3±1.3%(n=3)，鉴定肽段数目为37±2.7%(n=3)；利用浓度分别为100,1and0.01的肌红蛋白(c(Cyt-c)和BSA的混合物进行评价，鉴定到的、Cyt-c和BS的序列覆盖率分别为57%、40%和17%，鉴定肽段数目为8、7和9，而自由溶液酶解，只有浓度最高的得到鉴定，序列覆盖率为36%，鉴定肽段数目为5，说明制备的新型IMER的较高的酶解效率。将其应用于酵母提取蛋白，酶解1.5min，通过L-共鉴定到271个蛋白而自由溶液鉴定到192个蛋白group(鉴定到至少两条唯一性肽段)，两者之间的overla达到了88.5，说明该I基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性胰蛋白酶，酶固载量可达到0.275mg/mg。磁性的引入不仅简化操作，而且作为微波吸收材料，可以加快酶解速度。将上述IMER对标准蛋白(BSA,Cyt-c,Myo.0.1mg/mL)进行15s微波辅助酶解，鉴定到的序列覆盖率分别为67%、64%84%，鉴定肽段数目为36、14、13，酶解效率同自由溶液酶解12h相当。将其进一步应用于鼠肝蛋白提取物分析，采用5min微波辅助酶解，鉴定到456个蛋白条肽段（1163独一肽段，FDR<1%）,对应333种蛋白质。加入PNGaseF白G）对该系统进行考察，结果显示，该系统对IgG分析的检测限为30fmol，灵敏度比传统方法（150fmol）提高了5倍。最后，将该系统用于复杂样品人血清的分析，在100nL血清中，鉴定到了80个糖基化蛋白和178个糖基化位点。磷酸化肽段富集-pH将其应用用于人血清中内源性磷酸肽的富集和衍生，并通过MALDI-TOFMS进行相对定量。从0.1μL血清中成功检测到4个磷酸肽，并进行二甲基标记后比较差异。该方法结合MALDI-TOFMS，可以进行高通量的筛选，在疾病的临床快糖肽富集-本课题通过将富集糖肽特异性高达90%测灵敏度（在使用0.01mg标准蛋白混合物以及400gBSA作为起始物质，仍然26%galectin-3bindingprotein可以作为潜在的临床肿瘤标记物。相符，且RSD值低于常规的溶液酶解的18.4%其中16种蛋白在高转移细胞株中稳定高表达，8种蛋白在低转移细胞株中高表（2鼠肝蛋白质在线酶解后鉴定肽段数目与常规溶液酶解相比从2271提高到5097。考察了在线酶解结合在重复分析并且保正两次定量结果相对标准偏差<50%时，仍然有约10%的肽段的相对定量结果超过2倍（在未整合在线酶解的系统中为1%。为了消除在线酶解技术在细胞在相对标准偏差<50%时只有小于1%的肽段相对量超过了2倍。同时，由于在线10万个细胞中定量到了约1700反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-重现性，三种蛋白质序列覆盖率的相对标准偏差分别为0%，2.3%和6.8%线方法相比，无论是鉴定的肽段数（4404vs.3942）还是蛋白质数目（1420vs.1250）均得到了显著提高，且分析时间缩短了近一倍（19.5hvs.41.5h。该平和常规的定量方法相比时间可以至少缩短24h。利用该平台对等量轻标记和重标为接近，而RSD值为19.63%，对于以质谱而言，该结果优于自由溶液的结果析前者，发现其中Cytochromec,somatic这种蛋白参与抑癌基因P53的信号传导和，相对偏差RSD<1.58%，动态范围1-15。通过优化二维色谱的色谱柱组合、色谱本研究构建了弱阴离子交换/反相液相色谱平台系统，工作流程如下：单上，进行样品的浓缩和除盐。在第二维的分离中，采用设计制作的8RPLC对多维液相色谱总ChangLiver和HepG2细胞表面糖蛋白的82.4%性。在这33个糖蛋白中选定了2个，EMMPRIN和BCAM，用western二、重要阶段性成果或突破（300-500字，另附图片后加入PNGaseF大地节省操作的时间，使得整个样品预处理过程能在2h内完成（传统方法的1/30检测限为30fmol，灵敏度比传统方法（150fmol）提高了5倍。将该系统用于复杂样品人血清的分析，在100nL血清中，鉴定到了80个糖基化蛋白和178个糖基化位点。该工作发表在AnalyticalChemistry（2012,84,5146−5153）杂志上。图1反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-本课题构建了一个基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台(如图2所示)，蛋白质样品首先通过微柱反相色谱分级，洗脱组分依次通过溶剂置换接口去除有机溶剂并调节溶液pH值，再进入固定化酶反应器酶解，酶解产物通过反相色谱预柱捕集，最后通过微纳RPLC-MS分析。以三种标准蛋白质混合物为样品，考察了该平台的性能，三种蛋白质（cyt-c、-乳球蛋白和BSA）的序列覆盖率分别为10%，55%和81%，与16h缩短到4h无论是鉴定的肽段数（4404vs.3942）还是蛋白质数目（1420vs.1250）均得到了显著提高，且分析时间缩短了近一倍（19.5hvs.